换一批欧洲山杨一号染色体显微分离、原位杂交分析及特异文库的构建
Microdissection, in Situ Analysis and Microcloning of Poplar Chromosome 1
摘要以欧洲山杨(Populus tremula)根尖细胞为材料,采用玻璃针分离法,通过显微操作器成功地分离出一号染色体.将分离到的单条染色体去蛋白、Sau3A 酶切,并在染色体DNA片段两端加上Sau3A 人工接头,进行两轮PCR扩增,得到了200～3 000 bp的DNA扩增片段.以DIG-dUTP标记的欧洲山杨基因组DNA为探针进行Southern杂交,结果表明显微分离出的染色体扩增片段与欧洲山杨基因组DNA同源,从而证明一号染色体DNA确实已被成功地扩增.以一号染色体第2轮PCR产物为探针进行荧光原位杂交,发现荧光信号较密集的分布于一号染色体,但同时荧光信号也出现在其它染色体的着丝粒及端粒区域.对第2轮PCR产物进行克隆,构建单条染色体DNA文库,经分析,该微克隆文库包含约3×105个重组子.随机挑选160个重组子进行鉴定,证明该文库的插入片段主要介于230～2 200 bp之间,平均800 bp.该文库的构建为欧洲山杨1号染色体特异探针的筛选、遗传图谱的构建、重要基因的克隆等研究奠定了基础.
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