换一批自剪切及活性相关位点的组合突变提高头孢菌素C酰化酶水解活力
Combining sites related to autoproteolytic cleavage and activity to improve the deacylation activity of cephalosporin C acylase
摘要7-氨基头孢烷酸是合成头孢类抗生素的重要中间体,利用头孢菌素C酰化酶直接催化头孢菌素C获得7-氨基头孢烷酸的一步酶法与其它方法相比更加经济和环保,其关键是获得高活性的头孢菌素C酰化酶.本文以来源于Pseudomonas sp.KAC-1的I类头孢菌素C酰化酶(CPCase-kac)蛋白序列为模版,对其基因进行全局优化设计,人工合成目的基因,并克隆至表达载体pET28b,实现了CPCase-kac的高效表达.但是重组蛋白CPCase-kac表达活性较低,且自剪切不彻底,表达蛋白中存在前体形式的CPCase-kac,而头孢菌素C酰化酶的自剪切和活性往往相关.对CPCase-kac分子中影响活性的Y150、Q220、F347氨基酸位点进行饱和突变发现,活力提高的突变体Q220W、Q220G-第二次自剪切明显降低,而活力提高的突变体Y150R、Y150N、Y150H、Y150W及F347H、F347Y,自剪切却没有显著影响.将这些突变进行组合,最终得到了比活力提高了8.3倍的突变体Y150W/Q220G/F347Y.虽然Y150W/Q220G/F347Y突变体活性显著提高,但是其也具有Q220G较差的第二次剪切的特性.同时发现,外部条件改变可以影响CPCase前体或α亚基的继续自剪切.这些发现为进一步提高CPCase-kac活性及应用打下了基础.
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关键词
头孢菌素C酰化酶7-氨基头孢烷酸头孢菌素C定点突变自剪切cephalosporin C acylase7-aminocephalosporanic acidcephalosporin Csite-directed mutagenesisautoproteolytic cleavage
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DOI
10.3724/SP.J.1145.2014.12005
发布时间
2015-07-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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