摘要背景与目的:近年来,嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T,CAR-T)细胞疗法在肿瘤治疗中取得突破性进展.γδ T细胞具有非主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)限制性识别抗原、广泛抗肿瘤活性和低移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)风险等特点,因此CAR-γδ T细胞疗法受到广泛关注,成为肿瘤免疫治疗研究的重要热点之一.然而,CAR-γδ T细胞制备过程中存在体外扩增效率不足、病毒转导效率低等关键问题,严重阻碍了CAR-γδ T细胞的研究和临床应用.本研究通过优化γδ T细胞的体外扩增培养条件和慢病毒转导策略,旨在构建高效制备CAR-γδ T细胞的体系.方法:首先通过筛选多种细胞因子组合及组合中各细胞因子的浓度优化γδ T细胞的扩增方案,通过评估细胞纯度、细胞活力、扩增倍数、细胞毒性和耗竭标志物表达水平,筛选出γδ T细胞最佳的培养条件.随后,通过确定转导前γδ T细胞的最优活化时间和慢病毒转导感染复数(multiplicity of infection,MOI)进一步优化CAR-γδ T细胞的转导条件.最后,依据优化后的方案制备CAR-γδ T细胞,并利用钙黄绿素释放法和流式细胞术验证其对靶细胞的杀伤活性,同时初步评估CAR-γδ T细胞诱导GVHD的潜在风险.结果:实验数据显示,相较于单一白细胞介素(interleukin,IL)-2培养组,IL-2+IL-7+IL-15联合培养方案显著提升了γδ T细胞的细胞纯度(73.67%±1.53%vs 90.69%±2.00%)、细胞活力(63.01%±7.05%vs 89.00%±3.61%)、扩增倍数(876.50±238.35倍 vs 1 627.50±472.15倍)和细胞毒性标志物CD16的表达(4.20%±1.73%vs 14.66%±0.58%),显著降低了耗竭标志物程序性死亡蛋白-1(programmed death-1,PD-1)的表达(35.67%±6.26%vs 21.10%±6.49%).细胞因子浓度梯度正交实验的结果表明,IL-2+IL-7+IL-15联合培养方案中IL-7和IL-15的最优细胞因子浓度为10 ng/mL.此外,在活化96～120 h使用MOI为5～10进行病毒转导,CAR-γδ T细胞具有最优的转导效率(96 h:12.87%±4.35%;120 h:11.37%±2.35%).经此优化体系制备的CAR-γδ T细胞对靶抗原阳性肿瘤细胞显示出特异性杀伤效应,并且未发现CAR-γδ T细胞诱导GVHD的证据.结论:IL-2+IL-7(10 ng/mL)+IL-15(10 ng/mL)联合培养方案结合活化96～120 h使用MOI为5～10转导制备的CAR-γδ T细胞在扩增能力、细胞纯度和转导效率等方面均显著优于传统方法.CAR-γδ T细胞疗法通过天然免疫受体与CAR介导的特异性识别实现协同抗肿瘤效应,且未观察到GVHD风险.本研究为CAR-γδ T细胞疗法的临床转化提供了关键的技术支撑,奠定了坚实的理论和实践基础.