人端粒酶逆转录酶慢病毒载体的构建及人肝细胞的初步筛选

Construction of lentiviral expression vector carrying teloomerase rvevrse transcriptase gene and preliminary screening for human hepatocytes

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摘要目的: 构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)慢病毒表达载体,将其转染人肝细胞L02并且通过杀稻瘟筛选出阳性克隆细胞.方法: 以PBABE-puro-hTERT质粒为模板PCR法获取目的基因attB1- hTERT-attB2,通过BP反应克隆至pDONR221;采用LR重组酶将pDONR221-hTERT和pLenti6/V5-DEST进行重组反应,形成pLenti6/V5-DEST- hTERT.将重组载体pLenti6/V5-DEST- hTERT与包装质粒充分混合,利用脂质体共转染293FT细胞,获得重组慢病毒颗粒.将其感染人肝细胞L02,通过杀稻瘟筛选获得阳性克隆.结果: 测序发现入门载体pDONR221包含的目的基因hTERT 1547位点存在点突变(原碱基A变成G),通过定点突变技术成功诱变并鉴定慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST- hTERT成功构建.重组慢病毒滴度为1×108 TU/L,获得20株稳定抗性的单克隆细胞.结论: 成功构建人端粒酶逆转录酶的慢病毒表达载体,获得稳定抗性的单克隆肝细胞,为进一步建立永生化肝细胞系奠定了基础.