柚皮素通过环核苷酸通路拮抗血小板聚集的体外研究

Antiplatelet aggregation of naringenin via cyclic nucleotide signaling: in vitro studies

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摘要目的: 探讨柚皮素拮抗二磷酸腺苷(ADP)诱导血小板聚集的作用机制.方法: 采用ELISA检测柚皮素对ADP诱导的大鼠血小板内环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)水平的影响.采用高效液相法检测柚皮素对血小板磷酸二酯酶(PDE)活性影响.采用Western blot检测柚皮素对ADP刺激的血小板内血管扩张刺激磷蛋白(VASP)磷酸化形式p-VASP(Ser157)、p-VASP(Ser239)的蛋白水平的影响.分别给予蛋白激酶A(PKA)抑制剂H89、蛋白激酶G(PKG)抑制剂Rp-8-Br-PET-cGMPS和蛋白激酶C(PKC)抑制剂GF109203X预先孵育血小板后,再用柚皮素处理,然后给予ADP刺激,Western blot检测p-VASP(Ser239)蛋白水平.采用血小板聚集仪进一步观察PKA抑制剂、PKG抑制剂预先孵育血小板是否影响柚皮素对ADP诱导血小板聚集的抑制作用.结果: 柚皮素剂量依赖性地升高ADP抑制的血小板内cGMP水平,而并不改变cAMP水平.柚皮素还能显著升高血小板PDE活性.Western blot结果显示,柚皮素可明显升高由ADP抑制的p-VASP(Ser239)水平,但不影响p-VASP(Ser157)的蛋白水平,预先孵育PKG或PKC抑制剂并不影响柚皮素对p-VASP(Ser239)蛋白表达的作用,而预先孵育PKA抑制剂后,则能抑制柚皮素对p-VASP(Ser239)蛋白表达的作用.PKA抑制剂能阻断柚皮素对血小板聚集的拮抗作用,而PKG抑制剂并不影响其作用.结论: 柚皮素可能通过升高血小板内cGMP水平和激活PKA依赖的信号通路来介导VASP的磷酸化,从而发挥抗血小板聚集的作用.