摘要目的:探讨Mce4C蛋白是否参与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)摄取利用胆固醇.方法:利用定量PCR技术分析不同浓度胆固醇(无胆固醇组、0.01％胆固醇组和0.1％胆固醇组)对MTB mce4C基因表达的影响.通过紫外-可见分光光度计测定培养菌液A600值绘制生长曲线和扫描电镜分析,了解MTB H37Rv野生株(WT)、mce4C基因敲除株(△mce4C)和敲除回补株(△mce4C+mce4C)的生长速率和形态差异.通过试剂盒定量测定或NBD-胆固醇荧光值测定菌体本身、培养基及感染细胞裂解液中胆固醇含量变化,明确Mce4C蛋白是否参与MTB摄取利用胆固醇.通过MTB不同组分分离结合免疫印迹实验明确Mce4C蛋白亚细胞定位.结果:mce4C基因表达量随苏通培养基中胆固醇浓度的升高(无胆固醇组、0.01％胆固醇组和0.1％胆固醇组)而升高,培养1周时mce4C相对表达量分别为1.000±0.588、1.390±0.162和3.622±1.031,差异有统计学意义(F=28.200,P=0.001).随着胆固醇苏通培养基培养时间(20、40、60、70、80 d)的延长,△mce4C A600值相比WT和△mce4C+mce4C 降低逐渐明显,至第 80 天时,△mce4C 的 A600 值(0.913±0.017)明显低于 WT(1.245±0.011)和△mce4C+mce4C(1.246±0.029),差异均有统计学意义(t=28.182,P＜0.001;t=17.140,P＜0.001).用胆固醇苏通培养基培养3种菌株时,△ mce4C菌体胆固醇含量相比WT和△mce4C+mce4C降低,而其培养上清中胆固醇含量升高,至21 d时,△mce4C菌体总胆固醇含量[(1.058±0.012)μg/ml]明显低于WT[(1.347±0.087)μg/ml]和△mce4C+mce4C[(1.505±0.021)μg/ml],而培养上清中 △mce4C 胆固醇含量[(16.371±0.753)μg/ml]明显高于WT[(7.740±0.422)μg/ml]和 △mce4C+mce4C[(7.274±0.131)μg/ml],差异均有统计学意义(t=4.621,P=0.044;t=25.679,P=0.002;t=-14.135,P=0.005;t=-16.827,P=0.004).在感染 THP-1 细胞不同时间点(4、24、48、72 h),△mce4C感染细胞裂解液中胆固醇含量均明显高于WT和△mce4C+mce4C,即使在感染4 h最低点时,△mce4C感染细胞裂解液中胆固醇含量[(7.749±0.017)μg/ml]也高于WT[(7.180±0.173)μg/ml]和△mce4C+mce4C[(6.725±0.288)μg/ml],差异均有统计学意义(t=-6.556,P=0.001;t=-7.106,P＜0.001).结论:mce4C基因的表达随培养基胆固醇浓度的升高而升高,mce4C基因敲除降低了 MTB在含胆固醇苏通培养基中的生长速率及MTB菌体胆固醇含量,增加了培养基中及感染细胞裂解液中的胆固醇含量,表明Mce4C蛋白参与了 MTB从外环境中摄取利用胆固醇,其编码基因缺失可使MTB在以胆固醇作为唯一碳源时的生长存在明显缺陷,这可能是MTB在人体内长期存活并可能致病的重要因素.