换一批隐孢子虫属RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的建立
Development of RPA-CRISPR/Cas12a assay for the detection of Cryptosporidium sp.
摘要目的 建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)联合规则成簇间隔的短回文重复序列CRISPR Cas12a技术的检测方法,快速、简便检测隐孢子虫属.方法 设计并合成针对隐孢子虫属核糖体小亚基rRNA(SSU rRNA)区域的RPA引物和CRISPR相关RNA(crRNA),建立RPA-CRISPR/Cas12a检测方法,制备隐孢子虫属、毕氏肠微孢子虫、溶组织内阿米巴、狒狒环孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫的质粒,验证RPA-CRISPR/Cas12a方法的灵敏度和特异性;用10份隐孢子虫阳性和10份隐孢子虫阴性核酸样本验证方法的实际应用效果.结果 在45℃ 20 min RPA和37℃ 30 min CRISPR条件下,RPA-CRISPR/Cas12a检测隐孢子阳性质粒的灵敏度为1拷贝/μl;毕氏肠微孢子虫、溶组织内阿米巴、狒狒环孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫质粒检测均为阴性;隐孢子虫阳性核酸样本的荧光信号值在804.66万到916.34万之间,均为阳性;隐孢子虫阴性核酸样本的荧光信号值在2.92万到68.16万之间,均为阴性.结论 初步建立了快速、简便、高灵敏的隐孢子虫RPA-CRISPR/Cas12a核酸检测方法,无需昂贵仪器,适合口岸快速诊断.
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关键词
重组聚合酶等温扩增规则成簇间隔的短回文重复序列隐孢子虫属Cryptosporidium sp.Recombinase polymerase amplification(RPA)Clustered regularly interspaced short palindromic re-peat(CRISPR)
分类号
R183.4（流行病学与防疫）
栏目名称
DOI
10.16408/j.1004-9770.2025.03.001
发布时间
2025-07-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
国家重点研发计划（2022YFC2302800）
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