换一批外泌体circRNAs ITCH/miRNAs靶向调控成骨分化、骨生成机制
Study on the mechanism of exosome circRNAs ITCH/miRNAs targeted regulation of osteogenic differentiation and osteogenesis
摘要目的 探讨外泌体(exosomes,Exo)来源环状RNA(circular RNAs,circRNAs)ITCH在骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化中的调控作用及分子机制.方法 将来自卵巢切除大鼠(OVX-Exo)和假手术大鼠(Sham-Exo)的BMSCs来源外泌体与骨髓来源的巨噬细胞共培养,以研究它们对破骨细胞分化的影响.为了阐明ITCH对BMSCs的成骨分化影响,将BMSCs分为Sham-Exo(假手术)组、OVX-Exo(卵巢切除)组、OVX-Exo+mimic-NC组和OVX-Exo+ITCH mimic组.为了证实ITCH通过抑制miR-23a-5p表达促进成骨细胞增殖和分化潜能,将BMSCs分为OVX-Exo+ITCH+mimic-NC 组和 OVX-Exo+ITCH+miR-23a-5p mimic 组.通过定量实时 PCR(qRT-PCR)确定 BMSCs 中 ITCH、miR-23a-5p 表达.分别通过CCK-8、茜素红染色和ALP染色检测细胞增殖、钙化结节和细胞活性情况.结果 与Sham-Exo组相比,OVX-Exo组TRAP阳性细胞的数量和破骨细胞标记物的mRNA表达显著升高(P＜0.05).OVX-Exo中ITCH mRNA表达水平显著低于Sham-Exo(P＜0.01).在BMSCs的成骨分化期间,ITCH表达在成骨诱导后的第5、7、9天显著增加(P＜0.01).与Sham-Exo组相比,OVX-Exo 组和 OVX-Exo+mimic-NC 组 BMSCs 细胞增殖显著降低(P＜0.05),而 OVX-Exo+ITCH mimic 组 BMSCs 细胞增殖显著高于 OVX-Exo+mimic-NC 组(P＜0.05).与 Sham-Exo 组相比,OVX-Exo 组和 OVX-Exo+mimic-NC 组 BMSCs 细胞ALP活性和矿物质沉积显著降低(P＜0.05),而OVX-Exo+ITCH mimic组BMSCs细胞ALP活性和矿物质沉积显著高于OVX-Exo+mimic-NC 组(P＜0.05).miR-23a-5p mimic显著降低了 ITCH-WT报告载体的荧光素酶活性,和miR-23a-5p抑制剂显著增加了 ITCH-WT 报告载体的荧光素酶活性.与 OVX-Exo+ITCH mimic+mimic-NC 相比,OVX-Exo+ITCH mimic+miR-23a-5p mimic组BMSCs细胞增殖、ALP活性和矿物质沉积均显著降低(P＜0.05).结论 ITCH在介导Exo调节骨形成和骨吸收中发挥重要作用,其过表达通过海绵miR-23a-5p促进BMSCs的成骨分化.
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