华支睾吸虫溶血磷脂酶基因的识别、克隆和序列分析

INDENTIFICATION AND CLONING AND SEQUENCE ANALYSIS OF A NOVEL GENE ENCODING LYSOPHOSPHOLIPASE HOMOLOGUE FROM CLONORCHIASIS SINENSIS

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摘要目的筛选cDNA文库识别华支睾吸虫新基因,并将所发现的华支睾吸虫溶血磷脂酶(csLysoPLAH)基因编码区克隆到原核表达质粒PGEX-4T-1和真核表达质粒pcDNA3上,为进一步研究其功能奠定基础. 方法对华支睾吸虫cDNA文库进行随机筛选并测序,在NCBI和ExPasy网站上进行序列分析,识别华支睾吸虫新基因,并应用Motifsan、NCBI Conserved Domain Search等程序对其进行结构域分析.根据PGEX-4T-1和pcDNA3上的克隆位点及所发现的csLysoPLAH cDNA编码序列设计引物,进行PCR扩增,扩增产物回收纯化后克隆到原核表达载体PGEX-4T-1和真核表达载体pcDNA3上.构建的PGEX-4T-1-csLysoPLAH、pcDNA3-csLysoPLAH重组表达质粒经PCR、双酶切及测序证实. 结果发现csLysoPLAH基因,完整阅读框含708个碱基,编码235个氨基酸,理论分子质量为25.262 8 ku,理论pI为6.03.序列分析表明,csLysoPLAH编码氨基酸序列与其它物种有较高的同源性,csLysoPLAH具有磷脂酶/羧酸酯酶保守功能域和完整的脂酶保守功能域,并含有丝氨酸酯酶特征性的标签肽(即GXSXG).所构建的重组原核和真核表达质粒经PCR、双酶切及测序证实与目标基因相符. 结论发现华支睾吸虫溶血磷脂酶基因,并成功构建原核和真核重组表达质粒.