外源性双链RNA在蚊虫细胞中介导的基因沉默

DOUBLE-STRANDED RNA-MEDIATED GENE SILENCING IN CULTURED MOSQUITO C6/36 CELLS OF AEDES ALBOPICTUS

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摘要目的近年来,双链RNA介导的基因沉默(RNA干扰)已在许多动植物中发现,并成为研究基因功能的强有力的工具.为确定蚊虫细胞中是否有RNA干扰现象,以期为利用RNAi效应消除蚊虫抗药性研究奠定基础. 方法设计5′端带T7启动子的绿色荧光蛋白(GFP)及糜蛋白酶特异性引物,PCR扩增目的基因获得5′端带有T7启动子DNA片段,体外转录成单链RNA,退火后形成双链RNA.转染带有GFP基因的昆虫细胞表达载体pAct.GFP和双链RNA进入C6/36 蚊虫细胞,72 h后收集细胞,用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测GFP的表达差异,用半定量RT-PCR检测GFP的mRNA的表达水平. 结果转染糜蛋白酶基因双链RNA和pAct.GFP质粒的细胞及仅转染pAct.GFP的细胞的GFP表达水平没有明显差异;转染GFP基因的双链RNA和pAct.GFP质粒的细胞的GFP表达水平显著下降,达40%～50%,GFP的mRNA的表达水平也相应下降了60%. 结论在蚊虫细胞内,双链RNA能特异性的抑制相应的同源性基因的表达,引起基因沉默,证实蚊虫细胞内RNA干扰现象的存在.