刚地弓形虫肌动蛋白基因的克隆与表达

Cloning and Expression of Actin Gene of Toxoplasma gondii

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摘要目的克隆和表达刚地弓形虫肌动蛋白(TgACT)基因,并分析其免疫反应性. 方法提取弓形虫RH株速殖子的总RNA.根据TgACT基因编码序列(登录号为XM_002369622.1)设计合成引物,进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增,扩增产物经双酶切后连接入pET-30a(+)载体.将重组质粒pET30a-TgACT转化至大肠埃希菌(E.coli)DH5α,阳性菌落经PCR和双酶切鉴定,并测序.pET30a-TgACT在E.coli BL21(DE3)中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定.分别用抗多聚组氨酸标签(Anti-His)抗体和兔抗弓形虫血清为一抗进行蛋白质印迹(Western blotting)分析. 结果 RT-PCR扩增产物约为1100 bp.菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒pET30a-TgACT构建成功.SDS-PAGE结果表明,目的蛋白在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达,相对分子质量(Mr)约为49000.通过蛋白的变性和复性处理及纯化,获得可溶性纯化蛋白.Western blotting结果显示,重组TgACT蛋白能被Anti-His抗体和兔抗弓形虫血清识别. 结论成功构建重组质粒pET30a-TgACT,获得刚地弓形虫重组肌动蛋白,且具有免疫反应性.