摘要目的 探索脑型疟发病过程中,星形胶质细胞被脑血管周炎性微环境诱导活化及其机制,及其对神经元损伤的影响.方法 4～5周C57BU6雄性小鼠经腹腔接种5 × 106个感染伯氏疟原虫ANKA株的红细胞,7～10 d后死亡,作为实验型脑型疟模型.新生3～5d的乳鼠,安乐死后分离脑皮层原代星形胶质细胞;24h内的乳鼠,安乐死后分离脑皮层原代神经元.以20 ng/ml γ干扰素(IFN-γ)、1 ng/ml肿瘤坏死因子α(TNF-α)和感染疟原虫的小鼠红细胞(pRBC)诱导星形胶质细胞活化,作为活化组,同时设置未处理静息态细胞作为对照组.24 h后用细胞裂解提取液提取总RNA测序,聚类分析生成热图,选取代表性的数个基因绘制小提琴图.ELISA测定细胞培养上清中CXCL10表达水平.分离脑型疟小鼠脾脏CD8+T细胞,与活化的星形胶质细胞共孵育,荧光显微镜下观察免疫突触及与CXCL10抗体共孵育后的CXCL10水平,流式细胞仪检测CD80等分子表达水平.原代神经元加入两组星形胶质细胞培养上清,在MAP2抗体中孵育,设置空白培养基作为空白组,乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒检测神经元损伤程度,CCK-8试剂盒检测神经元活力.Western blotting检测STAT1、STAT3及其磷酸化分子水平,活化组加入STAT1通路抑制剂氟达拉滨,免疫荧光染色观察神经元形态.采用PRISM Graph Pad 8.0软件进行统计学分析,两两比较采用t检验.结果 活化组星形胶质细胞形态由扁平星状变为长梭形,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)相对含量为(1.36±0.03),高于对照组的(1.00±0.00)(t=13.33,P＜0.01);活化组细胞培养上清中的CXCL10含量为(7.07±0.81)ng/ml,高于对照组的(2.57±0.28)ng/ml(t=9.05,P＜0.01).转录组分析显示,活化组抗原加工、提呈与T细胞趋化因子转录水平上调(均P＜0.01),CD80、CD86、MHC Ⅰ表达水平上调.活化组和CD8+T细胞共孵育形成"免疫突触",CD8+T细胞CD69表达量提高.LDH结果显示,活化组上清刺激后神经元相对死亡率为(50.2±2.4)％,高于空白组(0％)和对照组(0％)(t=20.62、20.62,均P＜0.01);CCK-8检测结果显示,活化组上清刺激后神经元相对活力为0.52±0.03,低于空白组(1.00±0.00)和对照组(1.42±0.06)(t=18.92、16.65,均P＜0.01);Western blotting结果显示,神经元经活化星形胶质细胞上清刺激后β-淀粉样前体蛋白(β-APP)相对表达量为0.44±0.02,低于空白组(1.00±0.00)和对照组(0.55±0.02)(t=37.28、4.93,均P＜0.01);促凋亡蛋白Bax与抑凋亡蛋白Bcl-2的比例为1.01±0.07,与空白组(1.00±0.00)、对照组(1.00±0.06)比较差异无统计学意义(t=0.31、0.13,均P＞0.05).Western blotting结果显示,活化组胞浆中STAT1、p-STATl蛋白相对表达量分别为3.40±1.08、4.00±0.82,均高于对照组(1)(t=3.13、5.13,均P＜0.05);活化组胞浆中STAT3、p-STAT3蛋白相对表达量分别为1.00±0.03、1.01±0.05,与对照组(1)差异无统计学意义(t=0.27、0.52,均P＞0.05).在活化组胞核中p-STAT1蛋白相对表达量为1.78±0.21,高于对照组(1)(t=5.081,P＜0.01)、p-STAT3蛋白相对表达量为1.02±0.02,与对照组(1)差异无统计学意义(t=1.38,均P＞0.05).对MAP2免疫荧光染色结果显示,活化组上清可造成明显的神经元损伤,经STAT1抑制剂处理后损伤得到缓解.结论 脑型疟发病过程中血管周炎性微环境可通过STAT1分子诱导神经毒性星形胶质细胞产生,可导致神经元死亡.活化星形胶质细胞与活化的CD8+T细胞相互作用,进一步加重中枢神经系统损伤.