摘要目的 结合多酶恒温快速扩增技术(MIRA)和荧光探针法,建立一种快速检测日本血吸虫特异性基因片段的方法.方法 以日本血吸虫非长末端重复序列反转录转座子(SjR2)片段为靶序列,设计并合成3对引物和荧光探针,建立荧光MIRA法反应体系,PCR检测,绘制扩增曲线.比较并筛选扩增效果较好的引物对和探针浓度;通过检测1 fg/μl、5 fg/μl、10 fg/μl、100 fg/μl、1 pg/μl和10 pg/μl等不同浓度的日本血吸虫成虫基因组DNA,评价该法的灵敏度;提取卫氏并殖吸虫、华支睾吸虫、东方次睾吸虫、颚口线虫及刚地弓形虫基因组DNA,并用荧光MIRA法检测,评价其特异度.耳缘静脉采集兔血,分离血清,制备含1 fg、5 fg、10 fg、100 fg、1 pg和10 pg日本血吸虫成虫DNA的兔模拟阳性血清并进行DNA提取,以荧光MIRA法检测,评估该法检测血清中日本血吸虫靶基因的最低限度.结果 引物对1(SjR2-1)的扩增效率较高,在反应第22个循环时(11 min)扩增出荧光产物,荧光值最高达170 000;探针量为0.6 μl/反应时具有较好的荧光强度和低荧光背景.建立的荧光MIRA法在39 ℃时第26个循环(13 min)时扩增出荧光产物,检测血吸虫成虫DNA的最低检出限为1 fg/反应.扩增产物电泳显示,血吸虫基因组DNA模板含量为10 pg、1 pg、100 fg、10fg时,均有电泳条带出现,电泳显示的检测限为10fg/反应,产物大小为186bp.仅含有日本血吸虫成虫DNA的反应管出现荧光扩增曲线,检测卫氏并殖吸虫、华支睾吸虫、东方次睾吸虫、颚口线虫及刚地弓形虫等基因组DNA未出现明显荧光扩增曲线.不同浓度的血吸虫DNA模拟阳性血清中,DNA含量为1 pg和10pg时,有阳性扩增曲线出现,最快于第16个循环(8 min内)即出现阳性荧光扩增信号,该法检测模拟阳性血清中血吸虫成虫DNA的最低检测限为1 pg/反应.结论 成功建立了一种检测日本血吸虫特异性基因片段的荧光MIRA法,该法反应快速、敏感性高、特异性强,具有潜在的日本血吸虫病诊断应用价值.