换一批艰难梭菌tcdA和tcdB基因绝对定量PCR方法的建立及应用
Establishment and application of absolute quantitative PCR method for tcdA and tcdB genes of Clostridioides difficile
摘要目的 建立基于SYBR染料法的能够精确定量艰难梭菌主要毒素tcdA和tcdB基因表达量的绝对定量PCR方法,并进行应用.方法 以CD12038艰难梭菌参考菌株为研究对象,扩增tcdA和tcdB基因的部分片段,然后将二者克隆到pUC57质粒载体中进行测序鉴定.采用梯度稀释的重组质粒为标准品,SYBR荧光染料法进行qPCR扩增,建立标准曲线.然后在4种主要的产毒性艰难梭菌流行参考菌株中验证菌株培养后tcdA和tcdB基因的拷贝数.结果 本研究建立了能够精确定量产毒性艰难梭菌tcdA和tcdB基因拷贝数的绝对定量PCR方法,其中tcdA基因的线性范围为(2.71 × 102～2.71 × 109)拷贝/μL,灵敏性为(324.70±33.42)拷贝/μL,批内变异系数(CV)为0.60％～1.12％,批间CV为0.57％～0.92％.tcdB基因的线性范围为(2.59×102～2.59× 109)拷贝/μL,灵敏性为(539.05±133.28)拷贝/μL,批内CV为0.37％～1.61％,批间CV为0.84％～1.76％.2个基因的溶解曲线均呈现单一峰值,特异性良好.对4种产毒性艰难梭菌参考菌株培养24 h后的tcdA和tcdB基因拷贝数研究结果显示,R20291(ST1/RT027)菌株的tcdA和tcdB基因表达水平最高,而其余3个菌株的表达水平较为相似.结论 本研究建立了基于产毒性艰难梭菌tcdA和tcdB基因的绝对定量PCR方法,该方法具有线性范围广、灵敏性高、特异性和可重复性良好等特点,为后续艰难梭菌主要毒素基因的精确定量研究提供了技术支持.
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分类号
R978.1（药品）
栏目名称
DOI
10.3969/j.issn.1001-8689.2025.02.005
发布时间
2025-03-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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