换一批稳定表达未折叠蛋白反应荧光报告基因的SH-SY5Y细胞系建立
Stable establishment of SH-SY5Y cell line expressing unfolded protein re-sponse fluorescence reporter gene
摘要目的 通过稳定表达 70 kD热休克蛋白(HSP)4 重组蛋白(HSPA4)-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的SH-SY5Y细胞系,直观实时反映细胞内未折叠蛋白反应(UPR)的变化.方法 以SH-SY5Y细胞的cDNA为模板,克隆HSPA4,并连接EGFP.将HSPA4-EGFP连接入慢病毒载体中,慢病毒转染SH-SY5Y细胞.使用 3 μg/ml嘌呤霉素处理细胞 1 个月,筛选得到HSPA4-EGFP稳转系.通过实时荧光定量聚合酶链反应(QPCR)、Western印迹、共聚焦显微镜检测等方法,证实HS-PA4-EGFP稳转系能有效且实时反映UPR的变化.结果 扩增到HSPA4-EGFP,并成功构建HSPA4-EGFP稳定表达的UPR报告系统.QPCR检测表明,构建的报告系统可以指示UPR.在激光共聚焦显微镜下,可以观察到细胞内绿色EGFP的点状分布,其能够反映UPR错误折叠蛋白的多少及分布,分别加入UPR激活剂、抑制剂后,细胞内绿色EGFP的点状分布明显增多和减少,差异有统计学意义(P<0.05).Western印迹检测到细胞中HSPA4-EGFP融合蛋白表达条带.结论 成功构建HS-PA4-EGFP稳转系,能够直观实时反映UPR变化,为深入研究UPR及其相关疾病(包括老年性疾病)提供工具.
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关键词
未折叠蛋白反应(UPR)70kD热休克蛋白4重组蛋白(HSPA4)-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)SH-SY5Y细胞Unfolded protein response(UPR)70 kD heat shock protein recombinant protein(HSPA)4-enhanced green fluo-rescent protein(EGFP)SH-SY5Y cells
栏目名称
DOI
10.3969/j.issn.1005-9202.2023.23.036
发布时间
2023-12-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
国家自然科学基金（81901918）
国家自然科学基金（81660204）
内蒙古自然科学基金项目（2019MS08060）
中央引导地方发展基金（2020ZY0040）
内蒙古自治区草原英才工程青年创新创业人才（Q2017047）
内蒙古自治区高等学校科学研究项目（NJZY22062）
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