ALEX1基因过表达慢病毒载体的构建和鉴定

Construction and identification of ALEX1-gene-over-expressed lentivirus vector

二维码有效期 120s

摘要目的:探讨构建Arm重复蛋白1(ALEX1)基因过表达慢病毒表达载体,感染乳腺癌细胞系SK-BR3后观察ALEXI的表达,为研究ALEX1在乳腺癌中的作用及机制奠定基础.方法:利用DNA重组技术将ALEX1基因插入到慢病毒穿梭质粒LV5中,获得重组慢病毒质粒V-ALEX1,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,用Lipofectamine 2000将重组质粒和慢病毒包装质粒系统(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)转染293T细胞中包装成重组慢病毒颗粒,经流式细胞术测定重组慢病毒滴度.将成功包装的ALEX1过表达慢病毒载体(LV5-ALEX1)和阴性对照载体(LV5-NC),感染SK-BR3细胞(MOI为10)48～72 h,Realtime PCR和Western blot法分析ALEX1表达情况.结果:酶切鉴定结果显示:产生约1 500 bp的片段,片段大小与ALEX1基因cDNA大小一致.DNA测序比对说明测序结果与预期ALEX1基因序列完全一致,证实ALEX1基因正确插入载体中,成功构建ALEX1基因过表达载体.经293T细胞包装后,成功获得病毒滴度为4.25x108 TU/ml的重组慢病毒LV5-ALEX1.Realtime PCR和western blot结果显示:与感染LV5-NC的SK-BR3细胞相比,LV5-ALEX1感染可明显增加ALEX1 mRNA及蛋白的表达水平.结论:成功构建ALEX1基因过表达慢病毒载体,ALEX1基因过表达慢病毒能够感染乳腺癌SK-BR3细胞,可使外源基因获得稳定过表达.