摘要[背景]随着规模化、集约化生产程度的不断提高,养殖过程中饲养空间受限、冷热环境不适等因素常使猪处于应激状态.内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)可能是最早期的应激反应,与细胞凋亡、代谢等方面有密切联系.肝脏是机体的主要代谢器官,猪养殖过程中由于人工操作(如断奶)、饲料霉变、温度变化和吸入有害气体等因素都会造成猪肝脏的ERS,不仅会造成肝脏损伤,还会引发肝脏的脂肪代谢紊乱和广泛的炎症反应,影响生产性能和繁殖性能.因此,深入探讨缓解ERS的有效措施,有助于减少猪养殖过程中的隐性损失.[目的]利用免疫沉淀联合质谱技术,从猪肝星状细胞中筛选在ERS条件下与葡萄糖调节蛋白94(GRP94)相互作用的细胞蛋白,为进一步探讨GRP94对猪肝星状细胞生物学功能的保护作用机理奠定基础.[方法]首先将GRP94 抗体固定在谷胱甘肽亲和磁珠上,用亲和磁珠与ERS条件下或正常条件下猪肝星状细胞总蛋白进行孵育,与GRP94 诱饵蛋白结合的蛋白复合物洗脱收集后,进行SDS-PAGE凝胶电泳验证.将验证成功的样品洗脱液进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测,鉴定出正常条件和ERS条件下GRP94的互作蛋白.运用生物信息学在线软件对筛选的互作细胞蛋白进行 GO 富集、KEGG 信号通路注释和蛋白互作网络分析,并对其中的互作蛋白之一波形蛋白(vimentin)进行免疫共沉淀验证.[结果]筛选到正常条件下与GRP94 存在互作关系的蛋白 146 个,ERS条件下与GRP94 存在互作关系的蛋白 76 个,在两种情况下都存在互作关系的蛋白 44 个.ERS条件下有互作关系的 76 个蛋白质主要参与凋亡过程负调控、肽段交联、泛素依赖型 ERAD(endoplasmic reticulum associated degradation)过程和过氧化氢分解代谢等过程.其中参与凋亡过程负调控的GRP94互作蛋白有albumin、catalase、filament A、heat shock protein family A member 5、keratin 18和prohibin 2,说明GRP94 可能与这些蛋白共同发挥抗凋亡作用.除此之外组成中间丝纤维的vimentin蛋白参与多个GO富集的通路,可能与GRP94 有重要的互作关系.进一步的免疫共沉淀试验也证实,ERS条件下vimentin和GRP94 之间确实存在互作关系.此外,某些ERS条件下特异性表达的GRP94 互作蛋白(如peroxiredoxin、death inducer obliterator 1、catalase、glandular kallikrein、pyruvate kinase等)与抗凋亡有密切联系.[结论]ERS条件下,猪肝脏GRP94互作蛋白主要参与抗凋亡、对未折叠蛋白进行折叠和维护细胞内稳态相关的信号通路.该结论为下一步开展GRP94参与肝脏ERS调控机制的研究打下基础.