屋尘螨第21类过敏原原核表达和过敏原性鉴定

Cloning and expression of Der p 21 gene from Dermatophagoides pteronyssinus and identification of its immunological characteristics

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摘要目的屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)是引起过敏性疾病的主要过敏原,鉴定其免疫原性是研究哮喘和其他过敏性疾病的基础.由于不同地区生物的多样性,本实验在国内首次对屋尘螨Derp 21进行克隆、表达和免疫原性鉴定.方法提取屋尘螨总RNA,RT-PCR扩增Derp 21的cDNA片段,根据已知Derp 21序列设计出表达引物,再通过已获得的cDNA和引物进行PCR扩增,将扩增产物连接到克隆载体上并转入克隆菌E.coli Top10中,涂板过夜培养,挑选菌落,保菌,取样送至公司测序.将测序正确的基因转入表达载体PET32中,经酶切鉴定测序再转入表达菌BL21中,大量表达重组蛋白Der p 21经过纯化后,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测目的蛋白表达并进行免疫印迹分析(Western blotting).结果双酶切显示Derp 21已成功连接在载体上,SDS-PAGE显示目标基因在大肠埃希菌BL21成功表达,纯化后的重组Der p 21蛋白分子量约为50 kD,Western blotting结果显示有明显条带.结论成功克隆表达Derp 21 cDNA,表达和纯化出重组蛋白,并具有免疫原性.