换一批葡萄球菌肠毒素A基因真核表达系统的构建及其目的重组蛋白的鉴定
Construction of eukaryotic expression system of staphylococcal enterotoxin A gene and identification of the target recombinant protein
摘要目的克隆金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因、构建其真核表达系统及目的重组蛋白的表达情况.方法采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌ATCC13565菌株中扩增全长SEA,目的扩增片段T-A克隆后测序.经核酸内切酶酶切重组质粒pUCm-T-SEA获得的pUCm-T-SEA基因片段与真核表达载体pPIC9K连接.采用电融合法将重组真核载体pPIC9K-SEA转化入P.pastoris GS115株,构建成真核表达系统pPIC9K-SEA-P.pastorisGS115.采用含G418抑制剂的YPD琼脂平板和PCR筛选并鉴定pPIC9K-SEA-P.pastorisGS115.0.5%(v:v)甲醇诱导下,采用SDS-PAGE检查BMMY液体培养基上清中重组SEA(rSEA)的表达情况.结果可从S.aureusATCC13565株DNA中扩增获得SEA目的片段.与报道的SEA基因序列(GenBank No.:AP004828 and L22566)比较,所克隆的SEA基因核苷酸及氨基酸序列的相似性分别高达98.84%～100%和100%.在甲醇的诱导下,pPIC9K-SEA-P.pastorisGS115能表达在SDS-PAGE图谱位于预期位置的rSEA.结论我们成功地构建了能表达SEA的真核表达系统,为进一步分析SEA分子中毒性相关活性位点、定位突变获得减毒或无毒的突变体奠定了基础.
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关键词
Staphylococcal enterotoxin ASEA gene/cloningeukaryotic expression system/constructionrecombinant protein/expression
分类号
R3（基础医学）
DOI
10.3969/j.issn.1002-2694.2004.04.009
发布时间
2004-06-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
Science Reseach Plan of Zhejiang Province（(2003C34010)）
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