刚地弓形虫ROP2-P30 复合基因在E.coli BL21中的表达和鉴定

Expression and identification of the multiple gene ROP2-P30 of Toxoplasma gondii in E.coli BL21

二维码有效期 120s

摘要目的获得编码弓形虫RH株棒状体蛋白2和主要表面抗原1重组复合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备.方法用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段,分别克隆入pMD18-T载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR.,双酶切和测序鉴定,将pMD-ROP2中的ROP2基因片段经EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切,连接等反应,亚克隆入pET-30a(+)原核表达载体构建pET-ROP2载体,然后再将pMD-P30中的P30基因片段与经BglⅡand EcoRⅠ酶切的pET-ROP2载体连接,构建pET-ROP2-P30载体,经含卡那霉素的LB平板筛选,酶切和PCR鉴定.阳性重组质粒转化到大肠埃氏菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS-PAGE进行鉴定.大量的表达融合蛋白经纯化和复性后,用Western blot分析.结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出特异的ROP2和P30基因片段,成功构建成pET-ROP2和pET-ROP2-P30载体,成功表达了弓形虫棒状体蛋白2和弓形虫棒状体蛋白与主要表面抗原1的融合复合蛋白,表达出的蛋白经纯化复性后具有免疫反应性. 结论 ROP2和P30基因重组后,在原核表达载体中表达出的蛋白经纯化复性后具有活性,获得纯化和复性的弓形虫ROP2和ROP2-P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础.