表达呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的重组人5型腺病毒的构建

Construction of recombinant human adenovirus type 5 expressing prefusion F protein of respiratory syncytial virus

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摘要目的筛选并构建成功表达A亚型人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus,HRSV)融合前构象F蛋白的重组人5型腺病毒(Recombinant Human type5 adenovirus,rHADV-5),为制备和研发HRSV重组腺病毒载体疫苗奠定基础.方法在真核表达载体pcDNA3.1(+)上插入具有不同突变位点的HRSV F蛋白编码序列,利用融合前F蛋白单克隆抗体AM14和D25筛选HRSV F蛋白突变体;通过同源重组将筛选出的前构象F蛋白突变体编码序列插入非复制型人5型腺病毒载体,在HEK293细胞中进行重组病毒的包装和扩增,经氯化铯密度梯度法获得纯化的重组病毒;应用夹心ELISA法和Western blot鉴定F蛋白的表达及构象.结果通过AM14和D25单克隆抗体筛选出了 2个稳定维持在融和前构象的HRSV F蛋白序列(SC-3M和SC-5M).将SC-3M和SC-5M编码序列插入非复制型人5型腺病毒载体,对两种重组人5型腺病毒(pAd5-SC-3M 和 pAd5-SC-5M)和空载体(pAd5-vector)纯化,病毒滴度分别达到 2.016 × 1010,2.52 × 1010和 2.948× 1011 IU/mL.pAd5-SC-3M和pAd5-SC-5M感染HEK293后均能高效表达HRSV融合前构象的F蛋白并维持三聚体结构,且pAd5-SC-5M感染细胞中F蛋白表达量高于pAd5-SC-3M.结论成功在体外传代细胞中获得可高效表达A型HRSV融合前F蛋白的重组人5型腺病毒,为进一步通过动物试验评价该HRSV重组腺病毒载体疫苗奠定了基础.

作者马亚林 ^[1] 柴鹏弟 ^[2] 王金冬 ^[3] 毛彤瑶 ^[2] 张鹏 ^[1] 李慧莹 ^[2] 段招军 ^[2] 学术成果认领

作者单位甘肃中医药大学公共卫生学院,兰州 730000;中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家卫生健康委员会医学病毒和病毒病重点实验室,北京 102206 ^[1] 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家卫生健康委员会医学病毒和病毒病重点实验室,北京 102206 ^[2] 潍坊医学院,潍坊 261000 ^[3]

关键词人5型腺病毒载体人呼吸道合胞病毒融合前F蛋白 HEK293细胞 human adenovirus type 5 vector human respiratory syncytial virus prefusion F protein HEK293 cells

分类号 R373

栏目名称

实验研究

DOI 10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.053

发布时间 2023-08-09