多光子激光扫描成像技术对活细胞内淀粉样前体蛋白裂解和β-淀粉样蛋白生成的观察

Observation of amyloid precursor protein cleavage and Aβ generation in living cells by using multiphoton laser scanning microscopy

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摘要目的在活细胞内探究淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的裂解和β-淀粉样蛋白(amyloid beta,Aβ)的生成机制.方法利用PCR扩增CFP(编码蓝色荧光蛋白),YFP(编码黄色荧光蛋白)和C99(编码APP最后99个氨基酸)三片段.含有54个碱基(编码APP中间18个氨基酸)的片段54bp由生物公司合成.CFP,YFP,54bp和C99四个片段连入载体质粒pcDNA3.0得到重组质粒pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP和pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99.将这两个重组质粒分别瞬时转染SH-SY5Y细胞.利用多光子激光扫描显微镜观察融合基因的表达,荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)检测APP的β裂解.免疫细胞化学和多光子激光扫描显微镜观察Aβ的生成.MTT检测转染细胞活性.结果 (1)限制性内切酶双酶切消化和测序分析鉴定重组质粒序列完全正确.(2)转染细胞内可以观察到蓝色和黄色荧光.(3)在pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP转染细胞中存在FRET现象;在pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99转染细胞中观察不到FRET现象.(4)免疫细胞化学和多光子激光扫描显微镜观察到在pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99转染的细胞中有Ap的生成.(5)Aβ的沉积广泛分布于细胞内.(6)随着Aβ在细胞内的产生和聚集,细胞的活性逐步下降.结论 C99对于APP的β裂解非常重要.早期Aβ首先在细胞内生成并在细胞内形成广泛沉积.细胞内聚集的Aβ会影响细胞活性,带来不利结果.

作者李晓晴 ^[1] 张苏明 ^[1] 杨华静 ^[1] 张智红 ^[2] 学术成果认领

作者单位华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科,武汉,430030 ^[1] 华中科技大学生物医学光子学教育部重点实验室,武汉,430030 ^[2]

关键词淀粉样前体蛋白 β-淀粉样蛋白 β裂解荧光共振能量转移 amyloid precursor protein amyloid beta protein beta-cleavage fluorescence resonance energy transfer

主题词细胞(Cells)蛋白(Egg White)淀粉样蛋白(Amyloid)淀粉(Starch)观察(Observation)

分类号 R742

栏目名称 ARTICLES

发布时间 2007-12-10

基金项目

the Key Project of Ministry of Education, China We thank Dr. Todd Golde (Neurogenetics Laboratory, Mayo Clinic, Jacksonville, FL, USA) for the generous provision of the plasmid pc

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