基于位点特异性整合评价CHO细胞表达系统启动子活性的研究

Evaluation of the Promoter Activity of the CHO Cell Expression System Based on Site-specific Integration

二维码有效期 120s

摘要工业生产上中国仓鼠卵巢细胞(CHO)药物蛋白质的表达水平受多种因素影响:调控元件对转录翻译的影响、基因组整合位点的影响以及表达系统的影响等.转录作为基因表达第一步,较大程度影响蛋白质的表达,其中启动子在转录起始发挥至关重要的作用.启动子筛选大部分通过瞬时转染或随机整合,但存在拷贝数不明确或整合位点随机等而无法准确评价启动子活性.位点特异性整合在一定程度上降低位置效应对外源基因造成的影响,并有可能提高外源基因的表达水平.本课题组前期在CHO细胞基因组中发现并验证了多个可稳定表达外源蛋白质的位点,本研究选择其中1个位点(2c6)用于启动子活性的评价.采用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别将猿猴病毒早期启动子(SV40)、小鼠延伸因子-1α(mEF-1α)、鸡β-肌动蛋白(cACTB)启动子和人磷酸甘油酸激酶启动子(hPGK)调控的报告基因(EGFP)表达盒定点整合至2c6位点上.通过流式分选仪分析细胞平均荧光强度,qPCR检测EGFP的mRNA水平,综合评价启动子的活性.结果表明,mEF-1α和cACTB启动子的活性优于SV40和hPGK.2次流式分选结果表明,位点特异性整合可以更为精确评价CHO细胞表达系统启动子活性.