人TPX2基因过表达慢病毒质粒的构建及其人宫颈癌细胞稳定表达株的筛选

Construction of lentivirus vector for over-expression of human TPX2 gene and screening of human cervical cancer cell line stably expressing TPX2

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摘要目的构建人TPX2基因过表达慢病毒质粒,并筛选该基因的人宫颈癌HeLa细胞稳定表达株.方法经PCR法扩增人TPX2基因序列,克隆至线性化的慢病毒载体LV11中,构建重组慢病毒质粒,进行酶切及测序鉴定.将鉴定正确的重组慢病毒及空载体LV11(LV 11-NC)分别与辅助质粒共转染293T细胞进行病毒包装,并检测病毒滴度.用重组慢病毒感染HeLa细胞,经不同浓度G418(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.O、1.2、1.5、2.0 mg/ml)筛选TPX2基因过表达稳转细胞株,同时设阴性对照(感染LV 11-NC慢病毒)及空白对照(未感染病毒).采用实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测各组HeLa细胞中TPX2基因mRNA转录及蛋白的表达水平.结果经酶切及测序鉴定证明重组慢病毒质粒构建成功.经293T细胞包装后,获得重组慢病毒的滴度为3×108 TU/ml.采用0.6 mg/ml G418成功筛选出TPX2过表达细胞株.与阴性对照及空白对照比较,感染重组慢病毒的HeLa细胞中,TPX2基因mRNA转录及蛋白表达水平均明显升高(P＜0.05).结论成功构建了人TPX2过表达慢病毒质粒,并筛选出TPX2稳定表达的HeLa细胞株,为进一步研究TPX2基因在宫颈癌中的作用奠定了基础.