摘要目的 建立重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)衣壳蛋白电荷异质性的成像毛细管等电聚焦电泳(imaged capillary isoelectric focusing,iCIEF)检测方法,并进行方法验证,以期为rAAV产品的表征研究、质量控制及生产工艺稳定性的监控提供可靠的检测方法.方法 将待测样品经变性处理后,采用紫外荧光检测模式进行iCIEF分析,进样时间设为55 s,电压为1 500 V,聚焦时间为1 min;随后将电压调整至3 000 V,并继续聚焦10 min.激发波长设为280 nm,发射荧光检测曝光时间设为80 s.以rAAV 5型空心颗粒(rAAV-E)为待测样品,验证方法的专属性、精密性、线性范围、准确性及定量限.采用建立的方法检测rAAV 5型实心颗粒(rAAV-F)样品的电荷异质性.结果 rAAV-E样品在pH 6.9～7.1之间呈现2个明显主峰(Peak1和Peak2),空白对照未检测到病毒衣壳蛋白峰;6次重复检测rAAV-E样品2个主峰Peak1和Peak2的pI均值分别为6.91和7.04,RSD均为0.14％,峰面积百分比均值分别为35.6％和55.8％,RSD分别为1.1％和0.4％;3个时间点检测rAAV-E样品2个主峰Peak1和Peak2峰面积百分比的RSD 分别为 3.45％和 3.38％,pI 的RSD分别为0.10％和0.11％;rAAV-E浓度在(4.08～6.12)× 1012vp/mL范围内,与Peak1和Peak2的总峰面积均值呈良好的线性关系,线性回归方程为y=54 888 x-76 556,R2=0.976;80％、100％和120％预期浓度rAAV-E样品2个主峰总峰面积的回收率均在80％～120％范围内;Peak1的定量限为1.02× 1012 vp/mL,Peak2定量限为0.76 × 1012 vp/mL.rAAV-F样品呈现Peak1 和 Peak2外,在酸性区域(pI＜5.85)还观察到明显的额外峰,这是rAAV-F区别于rAAV-E的主要特征,也表明其具有复杂的电荷异质性分布.结论 建立的iCIEF法具有良好的专属性、精密性及准确性,可用于rAAV衣壳蛋白电荷异质性的分析.