摘要目的 建立重组人胸腺素β4(recombinant human thymosin beta 4,rh-Tβ4)滴眼液中蛋白含量检测的反相高效液相色谱(reversed-phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)法,并进行验证,以期对 rh-Tβ4滴眼液中蛋白含量进行质量控制.方法 用ZORBAX 300SB-C18(4.6 mm × 250 mm,5 μm)色谱柱,以超纯水、乙腈、三氟乙酸为流动相进行梯度洗脱,紫外检测波长为210 nm,进样量为100 μL,流速为1.0mL/min,柱温为25 ℃,样品室温度为5 ℃,以标准曲线法计算滴眼液中蛋白含量;对方法进行系统适用性、专属性、线性与范围、准确性、重复性、中间精密度、溶液稳定性、耐用性验证.用建立的RP-HPLC法检测4批rh-Tβ4滴眼液蛋白含量.结果 系统适用性主峰理论塔板数分别为192 039、185 819、186 348,均不低于5 000,主峰与相邻峰分离度分别为3.88、3.79、3.76,均大于1.5,系统适用性合格;空白溶剂、空白对照均未影响重组rh-Tβ4主峰积分,对检测结果无干扰,方法专属性良好;蛋白含量在50～150 μg/mL范围内标准曲线线性良好,相关系数(R2)为0.992 3,大于0.99;高、中、低浓度标准品回收率分别为98.01％、99.17％、97.70％;同浓度6份样品蛋白含量的RSD为1.38％;不同实验人员不同日期检测同一样品蛋白含量的RSD为1.05％;在0、6、12、18、24h内,同一份供试品蛋白含量的RSD为0.36％;供试品在23、25和27 ℃柱温下蛋白含量的RSD为0.45％.4批rh-Tβ4滴眼液蛋白含量分别为0.51、0.51、0.49、0.50 mg/mL,均与标示量一致.结论 建立了rh-Tβ4滴眼液蛋白含量检测的RP-HPLC法,经验证准确可靠,可对rh-Tβ4滴眼液中蛋白含量进行质量控制.