柯萨奇病毒B组4型TaqMan探针一步法实时荧光定量PCR检测方法的建立及验证

Establishment and verification of a TaqMan one-step real-time fluorescence quantitative PCR method for Coxsackievirus B4

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摘要目的建立柯萨奇病毒B组4型(Ccoxsackievirus B4,CVB4)TaqMan探针一步法实时荧光定量PCR(real-time fluo-res-cence quantitative PCR,RT-qPCR)检测方法,并进行验证,以期为CVB4的快速定量检测提供可靠方法.方法选择CVB4的VP1序列中较保守部分,设计引物和探针;经体外转录获得阳性RNA标准品,绘制标准曲线,建立CVB4的TaqMan探针一步法RT-qPCR法.验证方法的灵敏度、线性范围、重复性、特异性.应用建立的方法检测16份临床样本.结果方法的检测灵敏度为103copies/μL;阳性RNA标准品在103～1010copies/μL范围内,与荧光单位(relative fluorescence unit,RFU)具有良好的线性关系,线性方程为:y=-3.742x+48.651,R2为0.998;重复性验证CV＜2％;与柯萨奇病毒B组其他血清型CVB2、CVB3、CVB5、CVB6,肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71),柯萨奇病毒A组(Coxsackie-virus A,CVA)8、10、12 型(CVA8、CVA10、CVA12),埃可病毒11型(Echovirus 11,E11)均无交叉反应.16份临床样本中12份为CVB4阳性.结论建立的TaqMan探针一步法RT-qPCR检测方法具有较好的灵敏度、特异性和重复性,可用于CVB4临床样品的检测.