摘要目的 建立生长分化因子5(growth differentiation factor 5,GDF5)蛋白制备工艺,并通过体内外试验探讨其在软骨损伤中的作用.方法 将gdf5基因与pCZN1载体连接构建重组质粒pCZN1-hGDF5,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)pLysS中,挑取单菌落,筛选高表达菌株,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析蛋白的表达形式;建立包涵体清洗、变性及稀释复性方法,通过Ni亲和柱层析和DEAE离子交换柱层析纯化蛋白;以小鼠成软骨细胞ATDC5为检测细胞株,MTT法测定rhGDF5蛋白促细胞增殖生物学活性.建立白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)诱导细胞损伤模型,通过RT-qPCR、Western blot法检测软骨相关基因及蛋白表达情况,阿利新蓝染色、碱性磷酸酶(alkaline phos-phatase,ALP)活力测定分析rhGDF5蛋白对软骨细胞分化的影响.通过冷溶法制备泊洛沙姆407(P407)和188(P188)温敏凝胶,流变仪检测其流变性.建立内侧半月板切除手术(destabilization of medial meniscus,DMM)诱发雄性C57BL/6J小鼠骨关节炎(osteoarthritis,OA)模型,经关节腔注射给药,每周1次,连续给药4周,处死小鼠,取其膝关节组织,经脱钙、石蜡包埋、切片后,进行番红固绿染色和免疫组化检测,并进行OARSI评分.结果 pCZN1-hGDF5重组质粒经双酶切(Nco Ⅰ/BamH Ⅰ)鉴定构建正确.筛选的rhGDF5高表达菌株蛋白表达量占菌体总蛋白的35％;表达的蛋白主要以包涵体形式存在,经变复性和柱层析获得相对分子质量约25 000、电泳纯度＞95％的rhGDF5同源二聚体蛋白;rhGDF5蛋白在25～800 ng/mL剂量范围内呈现良好的促ATDC5细胞增殖作用,且高剂量蛋白未导致细胞毒性的发生;rhGDF5蛋白可有效促进软骨细胞数目增加和蛋白聚糖的分泌,并显著抑制ATDC5细胞ALP表达;细胞试验的RT-qPCR和Western blot结果显示,与IL-1β组相比,给予rhGDF5蛋白可使Ⅱ型胶原蛋白(collagen type 2,COL-2)和Y染色体性别决定区-盒转录因子9(SRY-box transcription factor 9,SOX9)的抑制得到有效逆转(COL-2:t分别为4.899和9.799,P 均＜0.05;SOX9:t 分别为 4.950 和 10.73,P 均＜0.05),基质金属蛋白酶 13(matrix metalloproteinase 13,MMP13)的表达得到显著抑制(t分别为6.500和23.51,P均＜0.05).冷溶法制备的含22％P407和5％P188的包载rhGDF5蛋白的泊洛沙姆温敏凝胶温度为(30.06±0.16)℃,胶凝时间为92.67 s.DMM小鼠OA模型试验结果表明,与对照组(0 ng/mL)相比,关节腔注射包载rhGDF5蛋白的温敏凝胶后,小鼠关节受损程度得到有效修复,其中以高剂量组修复效果最好,OARSI评分为1分;其次为中剂量组,OARSI评分为1.67分;低剂量组则无明显作用,OARSI得分为5.33分;免疫组化结果也显示,与对照组相比,给予rhGDF5蛋白治疗后,COL-2的分布增多.结论 成功建立了简单高效的rhGDF5包涵体蛋白复性、促二聚化及纯化关键制备工艺,并通过体内外试验证明了其对软骨的有效作用,为进一步开展OA治疗产品的研制提供了技术支持.