摘要目的 采用抗体芯片筛选抗结核先导化合物M6的潜在靶标,在E.coli中表达耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Ms)靶标蛋白甲基-D-赤藓醇4-磷酸-胞嘧啶转移酶(2-C-methy1-D-erythriol 4-phosphate cytidylyl-transferase,IspD),并制备其多克隆抗体,以期为深入研究该蛋白功能和开发新型抗结核药物提供实验依据.方法 测定M6对Ms和谷氨酸棒状杆菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC).采用抗体芯片捕获并分析经M6处理的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum,Cg)的蛋白样品,结合质谱鉴定技术鉴定筛选差异靶标.通过PCR法扩增获得Ms的ispD基因,并将其克隆至载体pET28a(+),构建重组质粒pET28a-ispD.将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中,通过优化诱导温度(16、25、33、37 ℃)和IPTG浓度(0～1.5 mmol/L),确定蛋白表达的最佳条件,并经镍柱亲和层析纯化重组IspD蛋白.以纯化的重组IspD蛋白为免疫原,联合弗氏不完全佐剂免疫11只雌性BALB/c小鼠,制备多克隆抗体.采用间接ELISA法测定抗血清效价,并通过Western blot法检测抗体的特异性.利用制备的多克隆抗体,通过Western blot法分析M6处理对Ms IspD蛋白表达水平的影响.结果 M6对Cg和Ms的MIC分别为0.5和32 μg/mL.IspD蛋白为M6作用的显著差异靶标蛋白之一.经双酶切鉴定,证明重组质粒pET28a-ispD构建正确,并在E.coli中表达了 IspD蛋白.确定最佳诱导条件为1.0 mmol/L IPTG,16 ℃诱导14 h.纯化后重组IspD蛋白纯度达95％,且可与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合.IspD蛋白多克隆抗体效价高达1∶102 400,可特异性识别重组菌裂解液中的IspD蛋白.经M6处理后,Ms IspD蛋白的表达水平未发生明显变化.结论 本研究通过抗体芯片成功筛选到M6的潜在靶标IspD蛋白,并在E.coli中表达了 Ms IspD蛋白,经免疫小鼠制备了其多克隆抗体,为深入研究IspD蛋白的功能和开发新型抗结核药物提供了实验依据.