摘要目的 建立重组腺病毒疫苗免疫后血清中具有中和活性的腺病毒抗体检测方法,并进行验证,以用于腺病毒临床血清中和抗体定量.方法 将荧光标记的重组腺病毒AdC68XY4-GFP与连续系列稀释的免疫血清中和后感染细胞,荧光斑点数降至中和前荧光斑点数的10％所对应的供试血清稀释度,即为该供试血清的腺病毒中和抗体滴度[记为抑制率90(inhibitory concentration 90,IC90)].采用等量病毒接种3种细胞(293A、HeLa和A549细胞),确定敏感性高的检测用细胞;分析重组腺病毒增殖曲线,确定数据判读时间;通过中和试验确定重组腺病毒的滴度使用范围.对建立的方法进行专属性、准确性、重复性、中间精密度、耐用性验证.结果 293A细胞对腺病毒最敏感;结果 判读时间为接毒后48 h;不同腺病毒滴度对应的荧光斑点均值呈线性关系(R2=0.970 3),确定重组腺病毒在接毒量为62.5～500 IFU/50 μL范围内结果稳定,选择线性中间点250 IFU/50 μL腺病毒进行试验.胎牛血清(FBS)的腺病毒中和抗体IC90＜1∶20,阳性对照血清的腺病毒中和抗体IC90为1∶96;阳性对照血清和临床血清003腺病毒中和抗体滴度检测的回收率均在50％～150％之间;阳性对照血清6次检测结果的RSD为8.27％,＜50％;3名实验人员不同时间同一样品2次检测结果的RSD为4.52％,＜50％;病毒增殖培养时间、铺板细胞量对腺病毒中和抗体滴度的影响符合可接受标准.结论 建立了重组腺病毒疫苗免疫后血清中具有中和活性的腺病毒抗体检测方法,通过重组荧光病毒与免疫血清中和后感染敏感细胞能快速检测腺病毒特异性中和抗体水平,该方法专属性、准确性、重复性、中间精密度、耐用性均符合验证要求.