摘要目的 构建诱导型永生化基因载体,并将其转染入原代细胞,从而建立条件永生化细胞系,实现原代细胞在体外的持续培养和增殖.方法 本研究应用基因同源重组技术,将永生化基因人端粒酶逆转录酶(hTERT)、猴病毒40大T抗原(SV40LT)、急性髓系白血病融合基因NUP98-KDM5A(N/K)和CBFA2T3-GLIS2(C/G),以及原癌基因KRAS的编码序列(CDS)定向插入到四环素(Tet)诱导型真核表达的慢病毒载体pLV2-TRE3GS-EGFP-MCS-3×FLAG-hPGK-Tet-On-SV40-Neo和转座子系统PB-TRE3G-3×FLAG-T2A-Puro-SV40-PA中.通过慢病毒包装及生产、细胞转染、基因mRNA表达检测、Western blotting蛋白表达检测、绿色荧光蛋白观测、细胞增殖检测等实验方法,分别在293T细胞和小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中验证载体的转染效率和Tet诱导表达功能.结果 本研究成功构建Tet诱导型慢病毒载体pLV2-Tet-SV40LT、pLV2-Tet-N/K、pLV2-Tet-C/G以及转座子载体PB-Tet-hTERT、PB-Tet-SV40LT、PB-Tet-N/K、PB-Tet-C/G和PB-Tet-KRAS.通过在293T细胞中的转染验证所有目标基因表达均显著上调.在MEF细胞进一步验证了SV40LT和N/K基因具有较强的永生化功能,并通过调节Tet诱导剂的添加控制了细胞的增殖水平.最终,成功构建条件永生化的pLV2-SV40LT-MEF和pLV2-N/K-MEF细胞系.结论 Tet诱导型永生化基因整合载体的构建为制备条件永生化原代细胞系和实现体外大量扩增血细胞(如红细胞和血小板)提供了重要的技术基础.