换一批实验动物金黄色葡萄球菌微滴式数字PCR检测方法建立和优化
Establishment of a digital PCR detection method for Staphylococcus aureus in laboratory animals using microdroplet technique
摘要目的 建立一种快速、准确的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,用于检测实验动物和环境中的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA).方法 针对SA耐热核酸酶基因(nuc)的保守区域,设计并合成一对特异性引物和探针,通过实验优化,确定最佳反应条件,检测动力学范围,验证该方法的特异性和方法再现性;以相同的模板分别进行ddPCR和实时荧光定量PCR(qPCR)方法反应,检测两种方法的互换性;最后将该方法用于各种临床样品的检测.结果 建立的SA ddPCR方法的动力学范围为100～15 000 copies/μL,检测极限为2.5 copies,定量极限为10 copies;检测该方法的特异性,结果仅SA有阳性微滴,其他病原体均无阳性微滴;对3个平行样本进行测量后,计算得到其标准偏差与相对标准偏差发现,在ddPCR的动力学检测区间内,随着目标拷贝数的逐渐降低,相对标准偏差呈现上升趋势,然而始终低于25％的,这一结果表明该检测方法具有良好的稳定性.t检验分析ddPCR和qPCR方法的检测结果,显示两种方法所得拷贝数均无明显差异.共检测10份临床样本,有2份临床样本为阳性,其他均为阴性,该结果与qPCR检测结果一致.结论 建立的检测SA的ddPCR方法灵敏度高、特异性强、稳定性好和重复性好,可用于实验动物SA的检测.
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DOI
10.3969/j.issn.1005-4847.2025.03.011
发布时间
2025-05-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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