摘要目的:研究新绿原酸(NA)直接结合的靶标蛋白及改善银屑病角质形成细胞增殖及炎症反应的分子机制.方法:以M5诱导HaCaT细胞作为银屑病角质形成细胞增殖及炎症细胞模型.首先使用细胞增殖与活性检测(CCK-8)试剂盒对合成的NA探针(NA-P)及NA原药进行细胞活力评价.在安全浓度范围下,对NA和NA-P进行药效评价,使用CCK-8检测0～100 μmol·L-1 NA及探针对M5诱导的HaCaT细胞增殖的影响,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测20、40、80 μmol·L-1NA及80 μmol·L-1NA-P对HaCaT细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-23、IL-17A炎症因子表达的影响,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测NA对HaCaT细胞角蛋白16(K16)、S100钙结合蛋白A9(S100A9)、S100钙结合蛋白A7(S100A7)、IL-6、IL-17A、趋化因子配体1(CXCL1)mRNA表达的影响.利用NA-P进行体外荧光标记及竞争实验,并利用下拉实验结合液相色谱-质谱联用技术(Pull-down/LC-MS/MS)进行靶标蛋白垂钓及分析.使用下拉实验结合蛋白免疫印迹法(Pulldown-WB)、细胞热转移分析结合蛋白免疫印迹法(CETSA-WB)实验、分子对接进行靶点验证.最后利用Real-time PCR检测20、40、80 μmol·L-1NA及80 μmol·L-1 NA-P对HaCaT细胞中IL-1β、核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、胱天蛋白酶-1(Caspase-1)mRNA表达的影响;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测磷酸化p65(p-p65)、p65、磷酸化人核转录因子-κB抑制蛋白α(p-IκBα)、人核转录因子-κB抑制蛋白α(IκBα)、热休克蛋白90(HSP90)表达的影响.结果:在200 μmol·L-1安全浓度内,与空白组比较,M5组HaCaT细胞增殖,TNF-α、IL-1β、IL-23、IL-17A炎症因子表达增加,K16、S100A9、S100A7、IL-6、IL-17A、CXCL1 mRNA 表达增加,与 M5 组比较,5～100 μmol·L-1的 NA 及 NA-P 组细胞增殖被抑制,NA低、中、高浓度组(NA-L组、NA-M组、NA-H组)、NA-P高浓度组(NA-P-H组)的TNF-α、IL-1β、IL-23、IL-17A炎症因子表达降低,K16、S100A9、S100A7、IL-6、IL-17A、CXCL1 mRNA 表达降低(P＜0.05).采用 200 μmol·L-1 的 NA 与 100 μmol·L-1的NA-P竞争,通过Pull-down/LC-MS/MS筛选出高置信度靶点HSP90蛋白.与空白组比较,M5组HaCaT细胞NLRP3、IL-1β、ASC、Caspase-1 的 mRNA 表达增加,p-p65/p65、p-IκBα/IκBα 增高,HSP90 蛋白表达增加(P＜0.05);与 M5 组比较,NA-L 组、NA-M 组、NA-H 组、NA-P-H 组细胞 NLRP3、IL-1β、ASC、Caspase-1 mRNA 表达降低(P＜0.05);NA-M 组、NA-H 组 p-p65/p65、p-IκBα/IκBα降低(P＜0.05),HSP90蛋白变化不明显.Pull down-WB显示NA可直接靶向HSP90蛋白,且NA结合HSP90蛋白可增强其热稳定性,NA与HSP90家族蛋白HSP90AA1、HSP90B1和HSP90AB1蛋白进行分子对接均可高度稳定结合.结论:NA可以抑制银屑病角质形成细胞增殖及炎症反应,其机制可能是通过靶向HSP90调控NF-κB/NLRP3信号通路实现的.