换一批猪流行性腹泻病毒Nsp8与宿主细胞互作蛋白的筛选及鉴定
Screening and Identification of Host Proteins Interacting with Nsp8 of Porcine Epidemic Diarrhea Virus
摘要猪流行性腹泻病毒Nsp8是RNA依赖的RNA聚合酶辅助因子,在病毒基因组复制中具有重要作用.为了从宿主细胞蛋白角度了解PEDV Nsp8蛋白的作用,本研究以PEDV感染的宿主细胞LLC-PK1为研究对象,提取LLC-PK1细胞总RNA,利用SMART技术经过反转录、扩增和纯化获得双链cDNAs,将其与pGADT7-Rec和carrier DNA共同转化至酵母Y187菌株,构建LLC-PK1 cDNA酵母文库,对该文库容量及质量进行鉴定.结果显示:本研究构建的LLC-PK1 cDNA文库库容量为2.1×107 CFU/mL,插入cDNA片段长度为500～2500 bp;将构建的诱饵质粒pGBKT7-Nsp8与LLC-PK1 cDNA酵母表达文库进行杂交,筛选阳性克隆菌株并测序分析,共获得了8个潜在互作蛋白;将8个蛋白分别与诱饵质粒pGBKT7-Nsp8进行酵母回复杂交验证,有4种宿主蛋白与Nsp8蛋白共转化后能在含X-α-Gal的DDO/X/A和QDO/X/A选择培养基中形成蓝色菌落;选择其中出现频率最高的LDHB蛋白与Nsp8,分别构建含有Flag标签和HA标签的真核表达载体,利用不同的标签抗体进行Co-IP鉴定,发现Nsp8与LDHB蛋白可以发生免疫共沉淀;通过激光共聚焦显微镜观察发现,Nsp8和LDHB蛋白在细胞质中存在明显共定位.本研究结果表明,Nsp8与宿主蛋白LDHB存在相互作用,推测LDHB蛋白可能通过与PEDV Nsp8蛋白在细胞质中的相互作用参与病毒复制的生物学过程.
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