换一批rAAV 2-GPⅡb/GPⅢa载体构建和体外表达、功能实验
Construction of rAAV2-GP Ⅱ b/Ⅲ a Vector and Test of Its Expression and Function In Vitro
摘要为了研究rAAV载体介导的血小板无力症基因治疗的可行性,构建了由CMV启动子调控的rAAV2-Ⅱb、rAAV2-Ⅲa病毒载体,并采用多种方法验证了rAAV2-Ⅱb和rAAV2-Ⅲa病毒载体在真核细胞中的表达能力,其中包括用RT-RCR方法检测BHK-21细胞感染24小时(MOI=1×105 v.g/cell)后目的基因在mRNA水平的表达,用流式细胞术的方法检测不同MOI和目的基因表达之间的量效关系,采用Western blot的方法检测BHK-21细胞感染48小时后(MOI=1×105v.g/cell)目的基因在蛋白水平的表达,用免疫荧光法检测BHK-21细胞感染48小时后(MOI=105 v.g/cell)目的基因在细胞表面的表达,以及应用PAC-Ⅰ结合试验验证所表达的GPⅡb/Ⅲa蛋白功能.结果表明,在MOI=1×105v.g/cell条件下,在BHK-21细胞感染24小时后即可在mRNA水平上检测到目的基因的表达,在48小时可在蛋白水平检测到目的基因的表达;在一定剂量范围内目的基因的表达量随着MOI的增加而增加,但MOI过高反而使表达量下降,目的基因表达产物活化之后能与PAC-I结合,并具有正常的生物学活性.结论:rAAV2载体能有效地介导GPⅡb、GPⅢa基因在真核细胞内表达,所表达的产物都具有正常的生物学活性,此结果为rAAV2载体在血小板无力症基因治疗中的应用打下了基础.
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10.3969/j.issn.1009-2137.2006.02.039
发布时间
2006-05-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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