换一批小鼠Qa-1基因有效shRNA干扰质粒的构建与筛选
Construction and Selection of the Most Efficient siRNA Interfering Plasmid Specific to Mouse Qa-1 Gene
摘要本研究构建3个针对小鼠Qa-1基因的小发夹RNA(shRNA)表达质粒,观察其对Qa-1基因的沉默作用,筛选出有效靶位.通过美国Ambion公司提供的siRNA web设计工具,选择3段针对Qa-1的siRNA,交由晶赛公司合成3个小发夹表达质粒,采用脂质体转染法转染NIH3T3细胞,第1、2、3组细胞分别转染3个小发夹表达质粒,第4组细胞单纯加入脂质体作为阴性对照,收集转染后24、48、72小时的细胞,用RT-PCR技术及流式细胞术对Qa-1在RNA水平的变化和细胞表面表达进行分析,筛选最有效的干扰片段.结果表明:成功构建了3个针对小鼠Qa-1的小发夹表达质粒.RT-PCR及流式细胞术检测证实,转染后3个组shRNA我体均可抑制Qa-1基因的表达,但抑制程度不一:24、48、72小时3个组细胞表面Qa-1表达减低率分别为H2-T231:60.9%,81.9%,43.6%;H2-T232为:64.5%,73.9%,61.1%;H2-T233为:61.9%,71.2%,47.5%.其中H2-T232组在3个时间点抑制作用均最明显.结论:构建的3个针对Qa-1的小发夹表达质粒均能抑制Qa-1的表达,其中H2-T232具有最有效抑制作用.
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