换一批产气荚膜梭菌重组α毒素蛋白高效液相尺寸排阻色谱定量方法的建立
Establishment of a High-Performance Size Exclusion Chromatography Quantitative Method for Recombinant Alpha-Toxin Protein of Clostridium perfringens
摘要为了建立产气荚膜梭菌重组α毒素(rCPA)蛋白的高效液相尺寸排阻色谱(HPSEC)定量方法,并评价其在疫苗工艺开发中的应用范围,本试验通过HPSEC、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹(Western blot)鉴定rCPA蛋白标准品及其色谱峰;筛选HPSEC色谱柱型号,优化流动相pH、盐浓度和检测流速;建立HPSEC检测rCPA蛋白的标准曲线,系统验证该方法的专属性、检测限、准确度、日内精密度和日间精密度,并评估该方法在rCPA蛋白细菌培养上清样品、浓缩样品和灭活样品中检测rCPA蛋白的适用性.结果显示,SDS-PAGE检测rCPA蛋白标准品纯度>90%,HPSEC纯度>95%;Zenix SEC-150色谱柱具有最优分离度、对称性和色谱峰面积;最优流动相为pH 6.8含有100 mmol/L NaCl的125 mmol/L磷酸盐缓冲液;最优流速为0.6 mL/min.HPSEC具有专属性和良好的线性(R2=0.999 98);检测限在4.9 μg/mL以下;HPSEC检测高、中、低3个浓度的rCPA蛋白标准品准确度介于96.2%～99.5%,准确度较高;日内和日间精密度良好,相对标准偏差均<5%;该方法适用于细菌培养上清中rCPA蛋白浓度的实时监测,以及浓缩样品和灭活样品中rCPA蛋白浓度的测定.结果表明,本试验所建立HPSEC定量方法适用性好、重复性好、准确度高,能应用于rCPA蛋白生产不同阶段样品的质量控制,指导疫苗工艺开发.
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关键词
高效液相尺寸排阻色谱(HPSEC)产气荚膜梭菌重组α毒素(rCPA)定量质量控制high-performance size exclusion chromatography(HPSEC)recombinant alpha-toxin of Clostridium perfringens(rCPA)quantificationquality control
分类号
S859.797
栏目名称
DOI
10.20157/j.cnki.zgsyzz.2026.04.004
发布时间
2026-04-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
新疆维吾尔自治区天池英才领军人才项目（ZH04）
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