换一批鸽源禽毛滴虫套式 PCR检测方法的建立与初步应用
Establishment and Preliminary Application of a Nested PCR Assay for Detection of Pigeon-Derived Trichomonas gallinae
摘要为了给鸽源禽毛滴虫病的早期诊断提供高效、准确的技术手段,本试验将套式聚合酶链式反应(PCR)技术应用于鸽源禽毛滴虫的检测,基于其18S rRNA基因序列设计特异性引物A1/S1和F2/R2,构建重组阳性质粒,优化反应条件以建立鸽源禽毛滴虫套式PCR方法,验证该方法的特异性和灵敏性,通过鸽毛滴虫复壮、人工感染检测和临床样品检测系统验证该方法的可靠性.结果显示,重组阳性质粒构建成功,并经测序验证其为鸽源禽毛滴虫的特异性序列.内、外引物的最适引物浓度均为0.08 μmol/L,最适退火温度分别为58和56℃.该套式PCR方法与大肠杆菌、沙门菌、白色念珠菌、艾美耳球虫和刚地弓形虫等常见病原体无交叉反应,特异性较强,且具有极高的灵敏性,最低可检测至0.25 copies/μL.在人工感染检测中,套式PCR方法可检测时间限远优于体外培养法和传统镜检法.临床样品检测中,PCR检测阳性率为73.21%(41/56),而套式PCR阳性率为96.43%(54/56).结果表明,本试验建立的套式PCR方法特异性强、灵敏性高,具有较强的实际应用价值.
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