肺炎克雷伯菌CS309耐药基因检测和NDM-1基因的克隆及原核表达

Detection of carbapenem-resistant genes in Klebsiella pneumoniae CS309 and cloning and prokaryotic expression of NDM-1 gene

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摘要目的检测产NDM-1肺炎克雷伯菌CS309是否同时携带产IMP、VIM型金属β-内酰胺酶或KPC型碳青霉烯酶的耐药基因,同时构建NDM-1基因原核表达质粒,并在大肠埃希菌中进行表达.方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增IMP、VIM和KPC耐药基因;以产NDM-1肺炎克雷伯菌CS309为DNA模板,PCR扩增NDM-1全长,并将其与pGEM-T克隆载体连接后转化至大肠埃希菌DH5α,继而对阳性克隆进行双酶切,将酶切片段与pET-28α(+)表达载体连接,并转化大肠埃希菌BL21,再用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,并采用SDS-PAGE和Western blot技术验证NDM-1蛋白.结果经PCR和测序证实,该菌同时携带NDM-1和IMP-4两种金属酶基因,未扩增出VIM、KPC耐药基因.经双酶切和测序证实,原核表达质粒pET-28α(+)-NDM-1构建成功.SDS-PAGE发现,重组菌株经诱导后在28 kDa附近有明显条带,与预期蛋白大小27.9 kDa一致.Western blot表明诱导产生的融合蛋白可与NDM-1抗体特异性结合.结论肺炎克雷伯菌CS309同时携带NDM-1和IMP-4两种金属酶基因;成功构建了NDM-1基因的原核表达质粒,该质粒在大肠埃希菌BL21中高效融合表达.