摘要目的 设计、构建并筛选出转染至人骨肉瘤细胞系OS-9901,对c-myc沉默效果最佳的复制缺陷型重组腺病毒质粒pAd-c-myc-短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)包装出表达c-myc-shRNA的重组腺病毒,并测定其滴度.方法 设计有shRNA结构的3对单链寡核苷酸(ss oligos),经变性退火为双链寡核苷酸(ds oligos),插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序正确后,经LipofectamineTM2000阳离子脂质体介导入人骨肉瘤细胞系OS-9901,采用RTPCR筛选对c-myc沉默效果最佳的穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,然后与腺病毒骨架质粒行同源重组,筛选出正确重组子.采用293A细胞包装出表达c-myc-shRNA的复制缺陷型重组腺病毒,观察其细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),采用病毒颗粒法(viral particles,VP)和50%组织培养感染剂量法(50%tissue culture infective dose,TCID50)测定病毒滴度.结果 电泳验证后的ds oligos插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序结果提示构建的pENTR/U6-shRNA质粒正确.从3对ds oligos通过RT-PCR方法筛选出对c-myc沉默效果最佳的穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,经Pac Ⅰ酶切线性化后同源重组成功构建了介导c-myc-shRNA复制缺陷型重组腺病毒,CPE和空泡现象3 d开始出现,6 d更加明显.采用VP法测定的第1代腺病毒滴度为5.23×109VP/mL,经3～4代扩增后可达2.26×1012 VP/mL.TCID50证实病毒滴度为10-3.8/0.1 mL.结论 通过RNA干扰技术,体外成功构建了介导shRNA-c-myc复制缺陷型重组腺病毒.