双表达去势DNA疫苗的构建及其稳定性研究

Construction and Stability Study of Co-expression Castration DNA Vaccine

二维码有效期 120s

摘要试验旨在构建一种更安全有效的新型免疫去势DNA疫苗,通过选取下丘脑-垂体-性腺轴(hypot halamic-pituitary-gonadal axis,HPG)的上游调控基因吻素1(KISS1)和促性腺激素释放激素(GnRH)作为靶标,借助2A肽的自剪切功能,引入平衡致死系统代替抗性基因筛选流程,成功将GnRH和KISS1转入非抗性筛选质粒pVAX-asd中,酶切验证和测序对比验证目的基因的插入方向和序列完全正确.重组质粒转染HeLa细胞,反转录后扩增目的基因结果显示,重组质粒在真核细胞内能够正常转录,保证重组质粒在导入机体后能够正常表达,从而引起特异性免疫反应.将构建成功的质粒转入减毒的猪霍乱沙门氏菌C500中,获得可直接口服免疫的活载体疫苗,酶切和测序结果表明,双表达重组质粒成功导入工程菌中.将活菌疫苗在体外连续传代50次,选取0、2、5、10、20、30、40、50代的菌株进行稳定性研究,生长曲线检测结果表明,工程菌在体外连续传代50次的过程中,其生长特性无明显变化,且与减毒猪霍乱沙门氏菌C500的生长特性一致,未因携带质粒发生明显变化;同时将各代菌液扩增沙门氏菌标志基因(invA)和毒力基因(crp),结果表明多次传代后工程菌仍然具有沙门氏菌的特性,其减毒特性也无变化.各代菌液质粒酶切验证显示,多次传代并不影响质粒的稳定性,重组双表达质粒能够在沙门氏菌C500中维持正常拷贝功能.综上所述,该重组质粒和工程菌疫苗均具有良好的稳定性,可直接应用于动物免疫去势的研究.