摘要[目的]分析非洲猪瘟病毒(Africa swine fever virus,ASFV)D250R蛋白潜在的生物学功能,制备其多克隆抗体,为ASFVD250R蛋白功能研究及相关诊断试剂的研发提供材料.[方法]应用生物信息学软件分析D250R蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构、磷酸化位点、生物功能及蛋白结构等.通过大肠杆菌表达系统表达重组D250R蛋白,采用镍亲和层析柱和分子筛纯化重组D250R蛋白,Western blotting检测纯化蛋白的反应原性,将纯化的D250R蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,用间接ELISA方法测定多克隆抗体效价,用间接免疫荧光试验(IFA)检测多克隆抗体特异性.[结果]生物信息学分析结果显示,D250R蛋白共由250个氨基酸组成,理论分子质量为29 822.54 u,理论等电点为8.96,为亲水性蛋白,无信号肽及跨膜区.修饰位点预测结果显示,D250R蛋白可能存在15个磷酸化修饰位点,其中丝氨酸(Ser)6个、酪氨酸(Tyr)6个、苏氨酸(Thr)3个;2个N-糖基化修饰位点,分别位于第61和197位氨基酸处.生物学功能预测结果显示,D250R蛋白含有Nudix序列,具有解水解酶活性.蛋白结构预测结果显示,D250R蛋白二级结构中α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲占比分别为49.20％、7.60％、15.20％和28.00％,三维空间结构存在较多α-螺旋,与二级结构预测结果基本一致.将ASFV D250R基因克隆至pET-32a(+)获得pET-32a-D250R重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在16℃、1 mmol/L IPTG诱导下,D250R蛋白以可溶性和包涵体2种形式表达,蛋白大小约44 ku,蛋白上清经镍亲和层析柱和分子筛层析纯化得到纯度较高的蛋白;Western blotting检测结果显示,重组蛋白具有良好的反应原性;间接ELISA检测结果显示,D250R蛋白抗体效价达到1∶256 000,成功制备多克隆抗体;IFA检测结果表明该多克隆抗体具有良好的特异性.[结论]本研究在分子层面分析了 D250R蛋白的理化性质及蛋白结构,在大肠杆菌表达系统中实现了ASFV D250R蛋白的高效表达,纯化的D250R蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体具有较高的特异性,为深入探讨ASFV D250R蛋白的生物学功能及ASFV相关诊断试剂的研发奠定了基础.