鸡白痢沙门氏菌IPAJ蛋白的表达纯化、多克隆抗体制备及ELISA方法的建立

Expression and Purification of IPAJ Protein of Salmonella Pullorum,Preparation of Polyclonal Antibody and Establishment of ELISA Method

二维码有效期 120s

摘要[目的]试验旨在建立以鸡白痢沙门氏菌的毒力相关基因所编码的IPAJ蛋白为抗原的间接ELISA方法.[方法]PCR扩增IPAJ基因并连接到pCzn1表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPAJ基因重组蛋白用IPTG进行诱导表达并纯化,通过Western blotting验证蛋白的反应原性.用纯化的IPAJ蛋白免疫60日龄试验兔,共免疫3次,制备其多克隆抗体,通过ELISA方法检测抗体效价.采用方阵滴定法优化以IPAJ蛋白作为诊断抗原的ELISA条件,初步建立以IPAJ蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法,并与平板凝集试验结果进行比较.[结果]试验成功构建鸡白痢沙门氏菌IPAJ原核表达载体,并以包涵体形式纯化出重组蛋白,具有良好的反应原性.Western blotting分析结果显示,成功表达出32 ku的IPAJ蛋白,具有良好的特异性.间接ELISA检测结果显示,多克隆抗体效价为1 ∶ 25 600,表明成功制备出多克隆抗体.建立的以IPAJ蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法的最佳优化条件为:抗原包被浓度为5 μg/mL,5％脱脂奶粉封闭1.5 h,一抗最佳稀释浓度为1 ∶250(孵育1 h),二抗最佳稀释浓度为1 ∶10 000(孵育1 h),避光显色15 min.与平板凝集试验结果的符合率为91.00％.[结论]鸡白痢沙门氏菌IPAJ重组蛋白具备良好的特异性及反应原性,初步建立的鸡白痢沙门氏菌间接ELISA诊断法具有一定的实用性,可应用于临床大批量检测,为后续建立快捷的诊断方法提供依据.