摘要[目的]构建稳定表达腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)/AMPK-T172D的NIH3T3细胞株,探讨AMPK对过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)诱导的细胞衰老的影响.[方法]采用PCR扩增AMPK基因及其突变形式AMPK-T172D,将其克隆至慢病毒载体pLVX-IRES-Puro中,构建pLVX-IRES-AMPK/AMPK-T172D重组质粒并进行双酶切验证.将构建好的重组质粒包装成慢病毒,感染NIH3T3细胞,并利用嘌呤霉素筛选获得NIH3T3稳转细胞株.采用实时荧光定量PCR及Western blotting检测稳转细胞株中AMPK的mRNA和蛋白表达情况.利用8.8 mmol/L H2O2处理AMPK/AMPK-T172D过表达NIH3T3细胞株,培养2 d后,采用衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associated-β-galactosidase,SA-β-Gal)染色检测细胞衰老情况,利用实时荧光定量PCR检测p53、p21及IL-6基因的表达情况.[结果]双酶切验证结果显示,pLVX-IRES-AMPK/AMPK-T172D表达质粒构建成功.实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示,与对照组相比,AMPK/AMPK-T172过表达的NIH3T3细胞中AMPK和AMPK-T172D mRNA和蛋白表达水平均极显著或显著升高(P＜0.01;P＜0.05),肉毒碱棕榈酰转移酶1(carnitine palmitoyltransferase-1,CPT-1)和脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FAS)mRNA表达水平显著或极显著升高(P＜0.05;P＜0.01),SA-β-Gal细胞阳性率极显著降低(P＜0.01);p53、p21和IL-6基因mRNA表达水平显著或极显著降低(P＜0.05;P＜0.01).[结论]试验成功获得AMPK/AMPK-T172D过表达NIH3T3稳转细胞株,激活AMPK能降低H2O2诱导的衰老细胞中SA-β-Gal细胞阳性率和衰老相关因子p53、p21和IL-6的表达.试验结果为研究AMPK在衰老中的作用、可能的分子机制及抗衰老治疗策略提供依据.