换一批溶血性曼氏杆菌截短型白细胞毒素的原核表达及多克隆抗体制备
Prokaryotic Expression and Polyclonal Antibody Preparation of Mannheimia haemolytica Truncated Leukotoxin
摘要[目的]构建溶血性曼氏杆菌截短型白细胞毒素(LktA)原核表达系统,表达融合蛋白并进行纯化和鉴定,为溶血性曼氏杆菌检测方法的建立提供物质基础.[方法]设计并合成特异性引物,PCR扩增羊溶血性曼氏杆菌lkta截短基因;用限制性内切酶EcoR I和Hind Ⅲ对PCR产物和pET-28b(+)载体进行双酶切,用T4DNA连接酶将溶血性曼氏杆菌lkta截短基因克隆到pET-28b(+)载体;使用IPTG诱导融合蛋白LktA的表达.通过Ni2+亲和层析纯化后采用SDS-PAGE和Western blotting对融合蛋白进行鉴定.用融合蛋白LktA免疫4月龄健康雌性新西兰大白兔制备多克隆抗体,4次免疫完成后进行抗体效价测定.[结果]测序结果表明,构建的表达载体中溶血性曼氏杆菌lkta基因序列正确;融合蛋白LktA的分子质量约为30 ku,在大肠杆菌中高效表达并以包涵体形式存在,在变性条件下纯化融合蛋白LktA电泳图显示条带单一,确定其纯度＞90％;纯化的融合蛋白LktA可与His抗体进行特异性结合.将纯化的融合蛋白LktA免疫新西兰大白兔后成功制备出多克隆抗体,抗体效价达1:256 000以上.[结论]本研究成功构建了羊溶血性曼氏杆菌截短型LktA的原核表达载体并制备其多克隆抗体,为后期溶血性曼氏杆菌检测方法的建立提供试验材料.
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关键词
截短型蛋白原核表达载体毒力因子致病机理truncated proteinprokaryotic expression vectorvirulence factorpathogenic mechanism
分类号
S852.61
栏目名称
DOI
10.16431/j.cnki.1671-7236.2023.06.032
发布时间
2023-07-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
国家自然科学基金（31902305）
内蒙古农牧业科学院青年创新基金项目（31902305）
内蒙古自治区自然科学基金项目（2022MS03069）
内蒙古农牧业创新基金项目（2018CXJJM05）
内蒙古自治区科技计划项目（2022YFHH0141）
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