CD163单等位基因表达的iPAMs细胞系的构建及其介导PRRSV感染的特征分析

Construction of iPAMs with CD163 Monoallelic Expression and Characterization of Their Mediating PRRSV Infection

二维码有效期 120s

摘要[目的]试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得CD163(cluster of differentiation 163)单等位基因表达的永生化猪肺泡巨噬细胞系(immortalized porcine alveolar macrophages,iPAMs),并探究其介导猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染的特征,为深入研究 CD163 基因在PRRSV感染中的作用机制奠定基础.[方法]在猪CD163基因外显子1区域设计8条向导RNA(single guide RNA,sgRNA),并将其连接到 pX458载体中,通过T7E1酶切试验检测不同sgRNA载体的活性;将活性较高的3条sgRNAs表达载体电转染到iPAMs中,通过流式细胞术分选单克隆细胞,对获得的单克隆细胞进行基因型鉴定、蛋白表达检测、脱靶分析以及PRRSV感染分析.[结果]在设计的8条sgRNAs中有3条基因编辑效率在28％以上.基因型鉴定结果表明,50株片段敲除的单克隆细胞中有4株符合预期的CD163单等位基因表达的iPAMs,效率为8％.蛋白表达检测和脱靶分析结果显示,CD163单等位基因表达的iPAMs中CD163蛋白表达量显著下降(P＜0.05),且在预测位置未发生脱靶现象.PRRSV感染分析显示,CD163单等位基因表达的iPAMs可以正常感染PRRSV,病毒拷贝数和PRRSV-N蛋白表达量与野生型细胞无显著差异(P＞0.05).[结论]本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统构建了可以正常感染PPRSV的CD163单等位基因表达的iPAMs,为阐明CD163在猪繁殖与呼吸综合征传染病中所起的作用以及培育抗病猪新品种奠定了基础.

作者王慧 ^[1] 冯保亮 ^[2] 向光明 ^[1] 黄雷 ^[3] 刘志国 ^[1] 李奎 ^[4] 牟玉莲 ^[1] 学术成果认领

作者单位中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193 ^[1] 天津市宁河原种猪场有限责任公司,天津301504 ^[2] 中国农业科学院深圳农业基因组研究所,深圳518120 ^[3] 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193;中国农业科学院深圳农业基因组研究所,深圳518120 ^[4]

关键词 CD163 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CRISPR/Cas9 永生化猪肺泡巨噬细胞系(iPAMs)CD163 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)CRISPR/Cas9 immortalized porcine alveolar macrophages(iPAMs)

分类号 S828.9

栏目名称 生物技术

DOI 10.16431/j.cnki.1671-7236.2023.07.003

发布时间 2023-08-15

基金项目

国家自然科学基金 科技创新重大项目 天津市科技计划项目