换一批禽腺病毒血清4型和8b型串联截短Fiber2-Fiber蛋白在毕赤酵母中的优化表达
Optimized Expression of Fowl Adenovirus Serotype 4 and 8 b Tandem Truncated Fiber2-Fiber Protein in Pichia pastoris
摘要[目的]在毕赤酵母中构建禽腺病毒(FAdV)血清4型和8b型串联截短Fiber2-Fiber蛋白表达系统,并探索适宜的表达条件.[方法]以前期构建的重组质粒pCold-Fiber2-Fiber为模板,用PCR法扩增Fiber2-Fiber片段,连接pPICZαA载体.经双酶切和测序鉴定后的阳性重组质粒pPICZαA-Fiber2-Fiber电转化毕赤酵母GS115.经MD平板和不同浓度Zeocin抗性筛选后进行PCR扩增和测序鉴定得到阳性菌株;用甲醇诱导表达阳性菌株,72 h后收集蛋白上清进行SDS-PAGE和液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)鉴定.采用单因素变量法对不同pH(5.0、6.0、7.0和8.0)、甲醇浓度(0.5％、1.0％、1.5％和2.0％)、时间(24、48、72和96 h)进行表达条件优化,用SDS-PAGE鉴定,并用间接ELISA和Western blotting验证重组蛋白的反应原性.[结果]成功构建了重组质粒pPICZαA-Fiber2-Fiber,对表达72 h后的上清进行SDS-PAGE发现1条约70 ku的特异条带,经LC-MS/MS鉴定为目的蛋白.串联截短Fiber2-Fiber蛋白的最优诱导条件为pH 6.0、1％甲醇、诱导时间72 h.间接ELISA和Western blotting结果显示该重组蛋白能与FAdV-4和FAdV-8b阳性血清特异性结合.[结论]Fiber2-Fiber串联截短蛋白可在毕赤酵母中稳定表达并具有良好的反应原性,为禽腺病毒双价亚单位疫苗的研发奠定基础.
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分类号
S855.3
栏目名称
DOI
10.16431/j.cnki.1671-7236.2023.08.003
发布时间
2023-10-11
基金项目
国家重点研发计划（2018YFD0501403）；
山东省现代农业产业技术体系家禽产业创新团队建设（SDAIT-011-03）
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