摘要[目的]试验旨在构建不同种类的新型免疫去势DNA疫苗,分别为KISS1、神经激肽B(NKB)单表达基因疫苗和促性腺激素释放激素(GnRH)、KISS1和NKB 3个基因共表达的三表达基因疫苗,注射到动物体内后能激发免疫反应,产生相应的抗体,从而达到通过调控生殖轴来降低雄激素的目的.[方法]选取下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamic pituitary gonadal axis)上的GnRH及其上游调控基因KISS1和NKB作为靶标,并引入平衡致死系统代替抗生素筛选构建重组质粒,其中三表达重组质粒借助2A肽的自剪切功能使目的基因共表达.将重组质粒转染293T细胞后提取细胞RNA,验证其能否在机体内正常表达,随后将构建成功的质粒电转到减毒猪霍乱沙门菌(Salmonella Choleraesuis)C500感受态细胞中,获得重组活菌疫苗,构建的工程菌在体外连续传代50次,选取第0、2、5、10、20、30、40、50代的菌株进行稳定性研究.[结果]重组质粒pVAX-2A/KISS1-asd、pVAX-2A/S-NKB-asd和pVAX-S/GnRH-2A/S-NKB-2A/KISS1-asd酶切分别获得大小为498、1 146和2 622 bp的条带,与目的基因一致;测序结果与目的序列比对后显示大小、方向一致,目的基因的插入方向和序列完全正确.将上述重组质粒转染293T细胞后进行RT-PCR,获得大小分别为498、1 146、1 349 bp的目的条带,表明目的基因在真核细胞内能正常转录.上述重组质粒电转到减毒猪霍乱沙门菌C500感受态细胞后,提取质粒酶切后获得大小分别为498、1 146和2 622 bp的条带,测序结果与目的序列比对后显示大小、方向一致,表明重组质粒成功导入减毒猪霍乱沙门菌C500中.每2 h检测的工程菌和减毒猪霍乱沙门菌C500对照菌D600nm值接近,差异不显著;生长曲线检测结果显示,工程菌在体外连续传代50次的过程中,工程菌和减毒猪霍乱沙门菌对照菌C500对数生长期均在0～10 h,10～14 h为生长平缓期,约16 h以后进入平台期,工程菌生长特性与减毒猪霍乱沙门菌C500的生长特性一致,未因携带质粒而改变.同时,各代菌液沙门菌种属标志基因invA和毒力基因crp的扩增条带大小均分别为580和599 bp,表明工程菌多次传代后仍具有沙门菌的特性,其减毒特性也无变化.各代质粒酶切片段大小均分别为498、1 146和2 622 bp,表明多次传代并不影响质粒的稳定性,且重组质粒能在沙门菌C500中维持正常拷贝功能.[结论]本研究构建的重组质粒和工程菌疫苗均具有良好的稳定性,且在导入机体后能正常表达,可用于动物免疫去势的研究.