摘要[目的]通过构建猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)VP6截短蛋白(第177-382位氨基酸)的原核表达系统,建立检测PoRV抗体的间接ELISA方法,为PoRV血清学监测提供检测手段.[方法]设计1对针对截短VP6基因的特异性引物,以pMD19-T-VP6重组质粒为模板扩增VP6截短基因.利用pET-32a(+)原核表达载体构建pET32a-PoRV-VP6重组质粒.以大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞为宿主菌,对重组质粒进行诱导表达,并优化表达条件.利用His标签镍柱对pET32a-PoRV-VP6重组蛋白进行纯化,以此作为包被抗原,通过单一变量法优化抗原包被浓度、血清稀释度、二抗稀释度及一抗、二抗孵育时间等工作条件.确定间接ELISA方法的阴阳性临界值,检验其特异性、敏感性、重复性及符合性,并对2021-2024年采自贵州地区不同猪场的384份临床猪血清进行检测.[结果]试验成功构建pET32a-PoRV-VP6重组表达载体,实现VP6蛋白的原核截短表达,蛋白分子质量大小约40 ku,具有良好的反应原性.对间接ELISA方法条件进行优化,确定VP6包被抗原最佳浓度为2 μg/mL、阳性血清稀释度为1:100、血清样品和二抗孵育时间均为60 min、TMB反应时间为10 min、阴阳性临界值(D450nm)为0.410.建立的间接ELISA方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪冠状病毒(PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒标准阳性血清不发生反应,特异性强;批内和批间重复试验变异系数均＜10％,重复性好;与PoRV A型ELISA抗体检测试剂盒的总体符合率为96.80％.间接ELISA方法检测临床384份猪血清样品结果显示,样品总阳性率为28.91％.[结论]本研究成功实现了 PoRV VP6蛋白的截短表达,并建立了 PoRV间接ELISA抗体检测方法,适用于临床PoRV抗体检测和疫苗免疫效果评价.