摘要[目的]利用CRISPR/Cas9 技术构建成纤维细胞生长因子受体 1(fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1)基因敲除牛乳腺上皮细胞系(bovine mammary epithelial cells,bMECs),探究FGFR1基因缺失对细胞存活、增殖及泌乳功能的影响,以期揭示其在乳腺发育和泌乳中的分子调控机制.[方法]针对FGFR1基因的第3、4外显子分别设计sgRNA并在体外鉴定切割效率后,构建FGFR1基因敲除质粒;电转染bMECs,利用嘌呤霉素和稻温毒素筛选7 d,收集细胞提取基因组DNA,经PCR扩增与Sanger测序鉴定FGFR1基因编辑情况;利用有限稀释法从目标编辑细胞群中挑取单克隆细胞,借助TA克隆技术进一步筛选出具有单一基因型的FGFR1基因敲除细胞株;通过Western blotting检测单克隆细胞株的敲除效率,利用CCK-8法测定细胞活力,采用实时荧光定量PCR检测单克隆细胞株中增殖和泌乳相关基因的表达情况.[结果]体外切割试验显示,2条sgRNA的切割效率分别为82.87%和27.80%,表明成功构建敲除质粒.电转染72 h后发现超过95%的bMECs带有红色荧光,且药物筛选后编辑区域出现多个双峰,证明编辑效果明显.挑取384株单克隆细胞,扩繁92株细胞,其中72株细胞FGFR1基因被编辑(78.26%),31株sgRNA1位点发生编辑(33.70%),55株sgRNA2位点(59.78%)发生编辑,最终获得8株形态饱满、长势良好的FGFR1基因敲除单克隆细胞株.测序结果显示,单克隆细胞株编辑位点呈片段缺失和碱基替换等多种编辑形式,其中KO#2细胞株的2个位点均发生编辑,且仅有1种编辑类型;Western blotting和CCK-8结果显示,与对照组相比,KO#2株细胞敲除效果极显著(P<0.01),但敲除FGFR1基因对细胞活力无显著影响(P>0.05).实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,敲除FGFR1基因后细胞增殖相关基因的表达量无显著差异(P>0.05),但泌乳合成相关基因的表达量显著或极显著降低(P<0.05;P<0.01).[结论]本研究成功构建1株FGFR1基因敲除的bMECs,且敲除FGFR1基因对细胞存活及增殖无显著影响,但可显著抑制其泌乳合成功能,这为进一步研究FGFR1基因在bMECs中的功能和作用机制提供了依据.